摘要

目的探讨丙型肝炎病毒核心抗原的转位表达与肝(癌)细胞凋亡的关系及其意义.

方法采用免疫组织化学方法检测HCV核心区抗原C22在肝硬变(LC)、肝细胞肝癌(HCC)组织中的分布；同时对连续切片进行原位凋亡检测并计算凋亡指数.

结果HCV核心区抗原定位于肝细胞或肝癌细胞的胞质或胞核中，在LC组织中，C22呈弥漫或灶状分布于肝细胞胞质，偶见胞核阳性的肝细胞，阳性率为60.7%；C22抗原在HCC细胞中以核阳性分布为主，阳性率为37.6%，癌旁肝组织以胞质阳性为多见. HCC中HCV核心抗原的核阳性率(75.0%，15例/20例)和阳性细胞数明显高于其在LC(17.7%，6例/34例)及癌旁肝组织(11.8%，2例/17例)中的阳性率(P＜0.05)和阳性细胞数. 在HCC中，HCV核心抗原核转位表达的癌组织的APOP LI凋亡指数值(0.174±0.093)显著低于胞质阳性的癌组织(0.512±0.113，P＜0.01).

结论HCV感染与我国LC，HCC的发生关系密切，HCV核心抗原在肝癌组织中常发生核转位表达，这种核转位表达使肿瘤细胞凋亡受到抑制，从而促进肿瘤组织的恶性生长.

中国图书馆分类号R735.7

Translocated expression of HCV core protein inhibits apoptosis in the tissue of hepatocellular carcinoma

LI Jiang¹，CHEN Yan-Fang²,WANG Wen-Liang¹ and LIN Shu-Guang²

¹Department of Pathology, Cancer Research Institute, Fourth Military Medical University, Xi＇an 710033, Shaanxi Province, China

²Division of Molecular Biology and Pharmacology, Guangdong Cardiovascular Institute, Guangzhou 510080, China

Subject headingshepatitis C virus; antigen, viral; liver neoplasms; carcinoma, hepatocellular; apoptosis

Abstract

AIMTo analyze expression of HCV core protein and apoptosis in formalin-fixed paraffin-embedded tissues of liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma.

METHODSImmunohistochemistry method was used to show the distributive pattern of HCV C22 antigen. Modified in situ end labeling(ISEL) was conducted on the serial sections.

RESULTSImmunohistochemistry showed expression of HCV core protein in the liver cirrhosis of 34/56 cases and HCC of 20/53 cases. The signals were mainly localized in the cytoplasm of hepatocytes. In liver cirrhosis and pericancerous tissues, ISEL showed that only cells expressing core protein might initiate apoptosis. However, translocated expression of HCV core protein was observed mainly in the nuclei of tumor cells in cancerous area. According to ISEL on serial sections, all these positive tumor cells hardly exhibited apoptosis (APOP LI for nuclear positive, 0.174vs APOP LI for cytoplasmic positive, 0.512，P＜0.01).

CONCLUSIONHCV core protein may express in the nuclei of tumor cells. Translocated expression of HCV core protein may inhibit apoptosis in the tissue of hepatocellular carcinoma.

0引言

自1989年Choo et al克隆出丙型肝炎病毒(HCV)以来，各国学者从分子病理和免疫病理的角度寻找HCV与宿主相互作用的关系，进行HCV特异性抗原的表达与HCV相关性肝疾病之间关系的研究，证实HCV感染是肝硬变(LC)，肝细胞肝癌(HCC)发生的一个重要危险因素^［1］. 肝(癌)细胞的凋亡与HCC的发生有着密切的联系. 越来越多的研究表明HCV的感染与肝(癌)细胞的凋亡有关^［2］. C22抗原为HCV核心区基因编码的蛋白，具有较高的保守性. 我们采用ABC法对HCV C22抗原在LC，HCC组织中进行定位研究并对连续切片进行原位凋亡检测，以进一步探讨HCV与肝(癌)细胞凋亡的关系.

1材料和方法

1.1材料①标本来源：均为我校西京医院1994/1996外科手术切除标本，并经病理证实，其中LC 56例，HCC 53例，45例带有癌旁肝组织. 所有标本经100mL/L福尔马林固定、脱水，常规石蜡包埋，制备5μm厚连续切片，APES胶对玻片进行处理以防脱片. ②试剂来源：HCV核心区抗原2B株C22抗原单克隆抗体由军事医学科学院基础所逯好英教授惠赠. ABC试剂盒购自Vector Lab. 原位凋亡检测采用Boehringer Mannheim公司生产的原位末端标记试剂盒.

1.2方法

1.2.1免疫组织化学染色：采用Vector Lab公司生产的ABC试剂盒对石蜡切片经常规脱蜡至水后， 严格按操作手册进行免疫组织化学染色. 除核染色者外，均用苏木素衬染，然后脱水透明封片. 对照实验：阳性对照选择血清HCV RNA阳性肝穿组织，阴性对照选择尸检胎肝组织，并做替代、空白对照、以保证结果的特异可靠.

1.2.2原位凋亡检测技术采用Boehringer Mannheim公司生产的原位末端标记试剂盒(Cat. No. 1684809)，根据操作手册和已有文献［3］进行原位凋亡检测，显微镜观察. 阴性对照为省去末端标记的反应液，阳性对照用0.5g/L DNA酶Ⅰ(Sigma公司)预处理组织. 结果是以核阳性为判定标准，并结合HE染色，对HE染色证实为坏死的细胞不记数. 随机移动组织片，选择相邻的10个视野. 排除有严重的炎症反应和坏死灶的区域，因为这两种情况会给单个凋亡细胞的鉴别带来困难. 凋亡指数(APOP LI)是记数每例组织片中200倍视野下凋亡的细胞数，共选取4～5个区域，计算均值.

1.2.3HE染色连续切片进行HE染色. 一般认为，典型的凋亡肝细胞HE染色表现为细胞体积变小、细胞核浓缩或颗粒状、染色体边集有的呈新月体状、以及胞质的嗜酸性增强^［4］.

2结果

2.1HCV核心抗原C22的分布特点和检出率应用HCV核心区抗原2B株单克隆抗体检测LC和HCC中的相应抗原发现，C22阳性信号见于肝细胞，HCC细胞的胞质或胞核中，呈细颗粒状均匀分布(图1a,1b). 在LC中，C22以胞质阳性为主，偶见胞核阳性细胞，分布多呈灶状，汇管区小胆管上皮细胞偶可见阳性(图1c). 在癌组织中，C22以弥漫或灶状核阳性分布为多见，亦可见胞质阳性的HCC细胞. 癌旁组织为弥漫或灶状分布的胞质阳性(图1d)，分布类似于硬化组织. 在LC及HCC组织中HCV的核心抗原C22的阳性率分别为60.7%(34例/56例)和37.6%(20例/53例). 提示HCV感染与LC，HCC的发生关系密切. χ²检验表明，HCC组织中的核心抗原的核阳性率(75.0%，15例/20例)和阳性细胞数明显高于其在LC(17.7%，6例/34例)及癌旁肝组织(11.8%，2例/17例)中的阳性率(P＜0.05)和阳性细胞数. 提示HCV核心抗原在HCC中发生了显著的转位表达.

图1在LC(图1a)和HCC(图1b)组织中C22阳性信号见于肝细胞、肝癌细胞的胞质或胞核中，呈细颗粒状均匀分布，汇管区小胆管上皮细胞偶可见阳性(图1c)，癌旁组织为弥漫或灶状分布的胞质阳性(图1d)，×400

2.2LC和HCC中细胞凋亡的特征结果显示，阳性信号为蓝紫色颗粒，位于胞核，呈小圆形或环形. 有些阳性细胞出现于肝窦中，大约10cm左右的小圆形颗粒，其形态难与淋巴细胞和Kupffer细胞区分. 在LC中，阳性细胞在小叶内多散在分布于小叶周边，靠近汇管区居多(图2a,2b). 而在癌组织中，既有散在分布的又有成簇分布的阳性细胞(图2c,2d). 在癌旁肝组织中阳性信号较前者少见. DNase Ⅰ作用的阳性对照为阳性，去除末端标记反应液的阴性对照为阴性. 连续切片对照HE染色，这些阳性细胞有的在形态学上表现为凋亡的细胞，即：胞核染色质浓缩、边集呈新月体样，胞质明显嗜酸性，有或没有胞质的浓缩，周围无炎细胞浸润，而有的并未出现上述的变化，推测这些细胞可能正处于凋亡的早期阶段.连续切片染色发现，在LC中，HCV C22阳性的细胞部分发生了凋亡，并且APOP LI(凋亡指数)值明显高于HCV阴性者. 比较HCV阳性的LC和HCC及其癌旁肝组织的APOPLI值. t检验显示，HCV核心抗原核转位表达的癌组织的APOP LI值(0.174±0.093)显著低于胞质阳性的癌组织(0.512±0.113，P＜0.01)，而癌旁组织的APOP LI无显著差异提示HCV核心抗原的核转位表达抑制了肿瘤细胞的凋亡过程，从而可促进肿瘤的进一步恶性生长.