中国图书馆分类号R730.5

Subject headingsneoplasms/therapy; suicide gene; gene therapy

1原文要点

作者应用逆转录病毒感染法将目的基因G1 CEA CDNa及pCD2分别转导入高分泌CEA的大肠癌细胞系(Lovo)中，再分别接种到裸鼠皮下，成瘤后腹腔给予5-FC(500mg/kg·d)治疗，疗程40d，结果显示含G1 cEA CDNa及pCD2 逆转录病毒载体的病毒滴度分别为1.3×10⁷及2.1×10⁸ cFU/L，所有转基因成功并接种动物均成瘤. 腹腔给予5-FC治疗后发现，转染含CEA基因顺式转录调控序列(TRS)CD基因(G1CEACDNa)的裸鼠移植大肠癌，对5-FC的疗效敏感性明显高于不含该调控序列CD基因(pCD2)转染的裸鼠肿瘤，治疗结束后肿瘤重量分别为3.1mg±8.0mg及113mg±23.0mg，病理组织学图象显示前者癌细胞数量稀少，形态生长不良，彼此统计学差异非常显著(P＜0.01).作者结论，CEA转录调控序列可控制CD基因在CEA阳性的大肠癌组织中高效表达，进而在前药5-FC的作用下发挥选择性杀伤肿瘤的作用.

2评论

2.1肿瘤基因治疗的由来^［1-14］基因治疗(gene therapy)作为肿瘤治疗的一种新手段，正愈来愈受到人们的重视和关注，它是分子生物学各项技术成熟基础上建立起来的.基因治疗是指把目的基因导入靶细胞和宿主体内，通过基因整合，成为宿主遗传物质的一部分，纠正错误的基因表达和基因表达的错误，以达到治疗目的，这一工作通常包括：基因置换(由正常基因置换掉疾病基因)，基因修正(纠正缺陷基因的突变碱基序列)，基因修饰(将目的基因导入病变细胞基因，其表达产物用以修饰缺陷基因导致细胞功能异常，或使正常功能得以加强)和基因失活(应用反义技术封闭不该表达的基因，以抑制有害基因，或直接抑制基因表达)等途径和内容.近10多年来，随着分子生物学技术和理论的飞速发展，使基因治疗这一新型治疗方法成为可能，并在对单基因缺陷性遗传疾病的治疗中取得了令人瞩目的成就.肿瘤的基因治疗研究也成为目前肿瘤防治研究的一个活跃领域^［1-2］.自Rosenberg(1989)^［3］利用逆转录病毒载体基因转移技术将细胞因子基因导入肿瘤浸润淋巴细胞，率先开展了肿瘤免疫基因治疗的临床试验以来，随着人们对肿瘤免疫、肿瘤发病的分子机制，以及细胞生长调控规律研究的深入，肿瘤的基因治疗研究获得了巨大推动力，开始逐渐走向成熟，已有许多临床试验计划得到了批准.迄今，人们已探索开展了免疫基因治疗^［4-5］，转导抑癌基因或反义癌基因治疗^［6-9］，以及自杀基因靶向化疗^［10-14］等极富发展前景的肿瘤基因治疗研究，初步结果令人鼓舞.肿瘤基因疗法具有下列优越性：①肿瘤的选择性比放疗、化疗更强，这可通过特异性基因转导技术或特异基因的定向作用而获得；②对患瘤个体损伤小而轻；③对晚期肿瘤或转移瘤灶仍有效.目前，肿瘤的基因治疗已成为世界医学界的热点，谈家桢院士认为21世纪的医疗革命将取决于基因治疗研究的成功.美国著名的Kelly博士预言，21世纪的基因治疗，将象20世纪免疫预防和抗生素一样给人类带来极其深远的影响^［15］.所以，崔龙等人能瞄准当前肿瘤基因治疗这一国内外热门研究前沿领域，选题开展应用性研究，并取得初步建树，实属可喜.

2.2肿瘤基因治疗的关键环节^［15-17］

2.2.1目的基因目的基因是弥补缺损基因及纠正异常基因的基因序列.目的基因纯化和扩增是基因治疗首先关心的问题，人体有30亿个碱基对，5万～10万个基因，从中正确选择所需的基因片段是成功的关键.提取目的基因的方法有：①用限制性内切酶把所需的基因切割下来；②用cDNA文库，即根据蛋白质(或酶)的氨基酸顺序选择的mRNA，然后用逆转录酶合成DNA；③人工合成DNA.从体细胞中获取的DNA比较困难且既有外显子又有内含子，而后两种方法所获得的DNA常常只有外显子，而无内含子.目的DNA提纯后尚需要扩增，扩增方法可使用PCR也可使用载体，如目的基因可以接种到大肠杆菌，当大肠杆菌繁殖时，目的基因也达到了大量复制，目前常用的还有质粒(plasma).质粒是细菌染色体外的遗传单体，其大小约在1kb～200kb，它往往具有以下特点：相对较小，便于操作，具有复制的起始点，加一段特殊基因片段(如耐药基团)作为标记，常常带有一个或几个可供选择的基因标记；质粒DNA序列中常包含了启动子、终止子，SD序列；这要求目的基因分子量＜10kb，一般为2kb～3kb.常用的质粒载体有pBR322，pUC118/119，pSP64/65，pGEM.其他常用的载体还包括λ噬菌体载体、粘粒载体、单链丝状噬菌体等.另外，目的基因选择后还需考虑2个问题：①基因必须连接完整信号肽序列，只有在启动子控制下，目的基因才能表达；②目的基因往往连上一个标记基因，如常用的耐药基因、TK基因.由于目的基因在载体或进入靶细胞时整合比率较低，使用标记基因便于从无数个细胞中选出确实整合的质粒或靶细胞.

2.2.2靶细胞的选择含将被纠正的异常基因的细胞称为靶细胞，在基因治疗中正确选择靶细胞是基因治疗成功的又一关键，理论上，基因治疗的靶细胞有两类：生殖细胞和体细胞，由于生殖细胞可以传给后代，特别是目的基因治疗尚不完善，为防止基因治疗给后代带来可能损害，改变人类基因信息体系，国际上从伦理方面考虑严禁用于人类生殖细胞，即使在动物身上使用也有严格限制.体细胞是基因治疗的主要对象.基因缺陷的器官或组织是首选材料.靶细胞要求必须容易获得且容易在体外培养.在体外作基因治疗时，要把靶细胞取出，把目的基因转入后再回输到体内，这一类最常应用于血液系统细胞，如红细胞、淋巴细胞、造血干细胞，此外还用于肝细胞.其次必须容易被转导，经验证明，凡靶细胞处于活跃分裂的细胞基因转移效率较高，在合适转导条件下，转染到在体外经刺激后分裂活跃的细胞.如骨髓干细胞和肿瘤细胞中，大多能取得较高转移效率，同时还必须有较长的寿命.为了使基因治疗终生或至少长期有效，期望靶细胞有较长的寿命，这方面比较理想的是骨髓干细胞和肿瘤细胞.在目前基因治疗实践中使用较多的靶细胞，除某些恶性肿瘤细胞外，还有肿瘤内浸润淋巴细胞(TIL)、骨髓干细胞、红细胞，以及肝、心、脾等实质器官细胞等，可以用于临床其他的靶细胞还有内皮细胞、上皮细胞、神经胶质细胞、成纤维细胞、骨骼细胞，但都有一定的局限性.

2.2.3转导(转移)方法的选择把目的基因直接或间接导入靶细胞过程称为转导或转移(translation).无论是体内还是体外，如何将基因导入机体细胞或肿瘤细胞，并获得安全有效表达是目前基因治疗研究的热门课题，向细胞内导入外源基因的方法较多，大体上可分为二类，一是非病毒转导法.如DNA-磷酸钙共沉淀、电穿孔、显微注射、脂质体介导、受体介导转移、DNA直接注射及基因枪等.其中DNA直接注射体内的方法简便，实用性强，易被临床所接受.它包括以下内容：①体内直接肌注质粒DNA，Wolff et al首先将质粒DNA注入小鼠股四头肌中并获得目的基因的表达，表达时间最长达18mo.这对肿瘤的基因治疗是有利的，因为肿瘤的治疗并不要求外源基因永久表达.目前认为肌细胞摄取质粒DNA可能与肌细胞的横管及肌浆网有关.②用脂质体包裹DNA后静脉注射，但其缺点是转导和表达效率较低，达不到治疗肿瘤所需要的表达量.二是病毒介导法.重组病毒具有天然的侵袭细胞和整合于宿主细胞的能力.目前研究和应用较多的病毒载体有腺病毒、逆转录病毒(RNA病毒)、腺病毒相关病毒和疱疹病毒等.彼此各有优缺点，文献中选用逆转录病毒作为导入目的基因载体的报道相对较多.

2.3自杀基因靶向化疗的特点与进展^［10-17］

2.3.1自杀基因(suicide gene)疗法亦称病毒介导的酶解药物前体疗法(virus-divected enzyme/produrg tharapy, VDEPT).其原理是将某些外源性酶解前药基因导入肿瘤细胞，使这些具有潜在毁灭性的基因获得内源性表达，生成特定的酶类，这些酶产物对进入肿瘤细胞无毒的或极低毒性的前体药物具有特别的敏感性，并能催化其转变成具有毒性的化疗药物，从而导致这些肿瘤细胞的死亡，即“自杀”.据知此类基因的作用不仅仅引起导入基因的肿瘤细胞“自杀”，尚可通过“旁观者”效应(bystander effect)杀伤未导入基因的邻近分裂细胞，显著扩大其杀伤效应.其发生机制认为可能与细胞连接交通，诱导细胞凋亡，增强肿瘤局部的抗肿瘤免疫以及造成肿瘤局部的血管损伤等有关.目前该领域的一个重要进展是组织特异性自杀基因疗法，即将肿瘤特异性启动基因与自杀基因连接并转染细胞，这样该系统只在含有必需转录因子的特定肿瘤细胞中表达，使得被激活的药物前体选择性介导细胞毒性作用破坏肿瘤细胞，例如，单纯疱疹病毒腺苷激酶(HSV-tk)能把核苷酸类似物GCV(ganciclovir)转化为一种毒性代谢物-三磷酸丙氧鸟苷，作为链的终止剂，干扰细胞分裂时DNA的合成，最终导致细胞阻抑或死亡.由此设计的治疗策略是将HSV-tk基因导入肿瘤细胞，随后用GCV进行治疗.这种方法的基础在于HSV-tk基因可选择性导入肿瘤细胞，不侵犯正常细胞，理想的治疗方法是使带有tk基因的逆转录病毒载体选择性地导入正在分裂的肿瘤细胞，然后加上GCV治疗，从而增加了肿瘤细胞对GCV的敏感性，提高其抗肿瘤效果.

由于哺乳动物细胞内不含有大肠杆菌胞嘧啶脱氨基酸(E.coli-cytocine deaminase, CD)基因，转导CD基因的细胞可将无毒性的5-氟胞嘧啶(5-FC)脱氨基转换成有毒性的5-氟脲嘧啶(5-FU)，从而导致细胞死亡.此种基因治疗方案首先是由Huber et al1991年针对原发性肝细胞癌的特点设