摘要

目的研究TGF_α，EGFR反义寡聚核苷酸抑制大肠癌HR8348细胞株恶性增殖的作用.

方法采用23个碱基组成的TGF_α反义寡聚核苷酸和21个碱基组成的EGFR反义寡聚核苷酸以及21个碱基组成的对照寡聚核苷酸作用于人大肠癌HR8348细胞，通过细胞生长抑制实验，³H-TdR掺入，mRNA斑点杂交及细胞周期分析以确定其对大肠癌细胞的增殖抑制作用和作用环节.

结果TGFα，EGFR反义寡聚核苷酸与对照寡聚核苷酸相比较，均能有效抑制HR8348细胞的增殖(P＜0.01)，DNA合成(P＜0.01)和mRNA(P＜0.01)的表达，并能有效地延缓HR8348细胞由G₀/G₁期向S期的转化，延缓了细胞的分裂增殖.

结论TGFα，EGFR反义寡聚核苷酸均能有效地抑制HR8348细胞的恶性增殖.

中国图书馆分类号R735.34

Effect of TGF_α, eGFR anti-sense oligodeoxynucleotides on colon cancer cell line

WANG Shu-Min¹, WU Jin-Sheng², yAO Xiu², HE Ze-Sheng²,and PAN Bo-Rong³¹Department of Thoracic Surgery and ²Department of General Surgery, Tangdu Hospital, FourthMilitary Medical University, Xi'an 710038,Shaanxi Province, China³Room 12, Building 621, FourthMilitary Medical University, Xi'an 710033,Shaanxi Province China

Subject headingsoligodeoxynucleotides;

transforming growth factor-α; epidemal growth factor receptor; colorector neoplasms

Abstract

aIMTo study the inhibitory effect of transforming growth factor-alpha(TGF_α), epidemal growth factor receptor(EGFR) anti-sense oligodeoxynucleotides on the malignant proliferation of the HR8348 cell line .

mETHODSTGFα, eGFR anti-sense oligodeoxynucleotides, composed of 23 and 21 bases, respectively, and indifferent oligodeoxynucleotides were used to affect the HR8348 cells. The cell growth inhibition, ³H-TdR incorporation,mRNA hybridization and the cell cycle analyses were made to identify the inhibitory effect and mechanism of TGFα, eGFR anti-sense oligodeoxynucleotides.

rESULTSTGFα, EGFR anti-sense oligodeoxynucleotides both could inhibit the proliferation of HR8348 cell; the DNA synthesis; the mRNA expression; and delay the transition period of g₀/G₁ phase to S phase.

cONCLUSIONTGFα, eGFR anti-sense oligodeoxynucleotides both could inhibit the malignant proliferation of the HR8348 cell effectively.

0引言

转化生长因子α(transforming growth factor α，TGF_α)与癌瘤细胞的关系十分密切，在人的多种肿瘤组织、癌细胞及转化细胞如延腺癌细胞^［1］、放射线转化细胞^［2］、膀胱癌细胞^［4］、肝癌细胞^［5］及大肠癌细胞^［6］均发现有TGF_α的高表达. tGF_α的最主要的生物学功能是促进细胞转化，引起细胞分裂增殖^［7］，在癌瘤的发生及发展中起重要作用.而在人的多种肿瘤组织、癌细胞如乳腺癌^［8］、食管癌、头颈部鳞癌^［9］、卵巢癌^［10］及大肠癌^［11］均有表皮生长因子受体(epidermal growth factor recptor, EGFR)的高表达，多数文献报道：肿瘤细胞EGFR表达增高主要在转录水平，且EGFR的过度表达能够促进肿瘤细胞的生长及局部浸润并增强转移趋势. hR8348细胞株是我国以人直肠低分化管状腺癌组织体外传代建立，能在体外长期传代培养，经各项鉴定表明有恶性细胞特性^［12］.我们以HR8348细胞株为研究对象，人工合成23个碱基组成的TGF_α反义寡聚核苷酸和21个碱基组成的EGFR反义寡聚核苷酸以及21个碱基组成的对照寡聚核苷酸，研究TGF_α，EGFR反义寡聚核苷酸对细胞增殖、DNA合成及mRNA表达的影响，并做了细胞周期分析，旨在进一步揭示TGF_α，EGFR在HR8348细胞增殖中的作用，为肿瘤基因治疗提供实验依据.

1材料和方法

1.1材料TGF_α， EGFR cDNA探针由上海生化所提供；³H-TdR为上海原子核研究所产品；RPMI1640为GIBCO产品；小牛血清为杭州四季青生物工程材料研究所产品. tGF_α反义寡聚核苷酸与TGF_α cDNA^［13］前6个密码子及其上游部位共23个碱基互补，序列为：5＇-TCCAGCCGAGGGGACCATTTTAG-3＇，EGFR反义寡聚核苷酸与EGFRcDNA^［14］的上游部位(包括起始密码)21个碱基互补，序列为：5＇—CGTCCCGGAGGGTCGCATCGC—3＇，均用硫代磷酸修饰；对照寡聚核苷酸的序列经计算机检索与TGF_α，EGFR，cDNA均无互补性，序列为5：＇—GGCCTCGGATCCTGCGCA—3＇.

1.2方法①细胞培养：HR8348细胞株由本实验室液氮冻存，复苏后培养于含40mL/L小牛血清的RPMI1640培养液，小牛血清65℃，1h灭活.②细胞生长抑制实验：取指数期HR8348细胞，胎盘蓝染色计数，观察细胞生存率(大于95%)，然后在与细胞计数平行的96孔培养板中分别加入含2，4，8，16μmol/L的反义寡聚核苷酸和对照寡聚核苷酸的培养液，培养24，48，72h后进行胎盘蓝染色计数，以下式计算生长抑制率：(N_n-N)/N_n×100%，N为处理后细胞计数，N_n为未处理细胞计数.③³H-TdR掺入实验：按文献［15］方法进行. 抑制率=(未处理cpm值-实验组cpm值)/未处理cpm值×100%.④mRNA斑点杂交：按文献［16］方法进行. ⑤细胞周期分析：按文献［17］方法进行.

2结果

2.1TGF_α，EGFR反义寡聚核苷酸对HR8348细胞增殖的抑制作用2，4，8，16μmol/L的TGF_α反义寡聚核苷酸对HR8348细胞生长的抑制率分别为21.7%，31.7%，38.7%，48.3%，而EGFR反义寡聚核苷酸对HR8348细胞生长的抑制率分别为15.0%，25.0%，33.3%，43.3%，两者抑制作用均随浓度升高而增强；而相同浓度的对照寡聚核苷酸对HR8348细胞的抑制率仅为5%，6.6%，10%，16.6%，较TGF_α，EGFR反义寡聚核苷酸的抑制作用明显减弱(P＜0.01)，但TGF_α，EGFR反义寡聚核苷酸两组间却无明显差异(P＞0.05)，且无剂效关系，说明TGF_α，EGFR反义寡聚核苷酸对HR8348细胞的作用均具有一定的特异性(图1).16μmol/L的TGF_α反义寡聚核苷酸对HR8348细胞的抑制率在12，24，48，72h分别为28.8%，41%，48.3%，25.4%，相同浓度的EGFR反义寡聚核苷酸的抑制率为31.4%，38.5%，43.3%，2.8%，而对照寡聚核苷酸为11.4%，12.8%，16.6%，8.5%，表明寡聚核苷酸对HR8348细胞的作用与时间有关，时间过分延长，抑制作用逐渐减弱(图2).

2.2TGF_α，EGFR 反义寡聚核苷酸对HR8348细胞DNA合成的抑制作用16μmol/L寡聚核苷酸对HR8348细胞的³H-TdR的掺入结果为TGF_α反义寡聚核苷酸作用于HR8348细胞48h对³H-TdR掺入的抑制率为46.9%，EGFR反义寡聚核苷酸的抑制率为37.7%，与对照寡聚核苷酸的抑制率7.2%相比均有显著差异(P＜0.01)，表明TGF_α，EGFR反义寡聚核苷酸均能有效地抑制HR8348细胞的DNA合成(图3).

图1不同浓度的寡聚核苷酸作用48h对HR8348细胞生长的抑制.

图2寡聚核苷酸16μmol/L在不同时间对HR8348细胞生长的抑制.

图3寡聚核苷酸16μmol/L对HR8348细胞H-TdR掺入的抑制作用.

2.3TGF_α，EGFR反义寡聚核苷酸对HR8348细胞TGF_α，EGFR mRNA表达的影响16μmol/L的TGF_α，EGFR反义寡聚核苷酸和对照寡聚核苷