Subject headingsmicrosatellite instability；DNA replication；colorectal neoplasms

中国图书馆分类号R 735.34

1原文的要点

作者应用PCR-SSCP技术，对大肠癌切除病例，从病理蜡块材料的回顾性研究中，找到24例多原发大肠癌及21例单发大肠癌，从蜡块中切下10余微米厚的癌组织，提取癌细胞中的DNA，进行PCR扩增后电泳，根据DNA带型，与正常的DNA条带比较，以寻找条带的移位，数目增多或减少等异常条带，即表示DNA重复序列的改变，以此证实为微卫星不稳定性阳性(MSI⁺)病例. 结果表明，多原发大肠癌为MSI⁺为71%，单发大肠癌MSI⁺为38%.

名词解释①微卫星微卫星(microsatellite, MS)是指DNA基因组中小于10个核苷酸的简单重复序列，又称短串联重复(short tandem repeat,STR)，是一种遍布于人类基因组的重复序列，一般为2～6个碱基重复，如(CA)n, (GT)n, (CAG)n等，尤以(CA)n重复序列最为常见. 其长度由重复单位的拷贝数决定，是一类呈高度多态的遗传标记，不仅可用于基因组遗传连锁图的构建以及基因的定位与克隆，而且可用于遗传性疾病的连锁分析和基因诊断^［1，2］. 其重复单位数目的改变可以引起相当高的多态性，但突变率仅为5×10^-4～5×10^-5，在家系中可以稳定地遗传，是一种很好的遗传标志. MS约占真核基因组的5%，其基本构成单位一般为1 bp～8 bp，多位于编码区附近，也可位于内含子、启动子及Alu序列中. 人类基因组约有5×10⁴～10×10⁴(CA)n重复序列. 通常认为重复序列的产生是由于在遗传物质复制过程中DNA滑动或在有丝分裂、减数分裂期染色体不对等交换所致，因此该重复序列多存在于不经严格选择的基因组区域. 目前普遍认为MS充当基因重组的热点，是基因重排和变异的来源. MS通过改变DNA结构或通过与特异性蛋白质结合而发挥其基因调控作用. ②DNA错配修复遗传物质的突变是导致人类许多疾病(包括肿瘤)的主要原因，而引起遗传物质突变的直接诱因是不同类型的DNA损伤. 其中多种原因造成的DNA双链分子的碱基错配是导致突变的主要DNA损伤类型之一. 大量研究表明，从细菌、酵母到人体细胞都存在一种能修复DNA碱基错配的安全保障体系，这种保障体系是由一系列特异性修复DNA碱基错配的酶分子组成，被称为DNA错配修复系统(DNA mismatch repair system, MMR). 人体细胞中由于MMR系统的存在，可保持遗传物质的完整性和稳定性，避免遗传物质突变的产生，保证DNA复制的高保真度. ③微卫星不稳定性微卫星不稳定性(microsatellite instability, MSI)是指由于复制错误(replication error, RER)引起的简单重复序列的增加或丢失，也称RER阳性或RER表型. MSI首先在结直肠癌中观察到.

2评论

微卫星DNA是1981年Miesfeld et al^［3］首次发现的，1993年，Altonen et al^［4］首次发现在HNPCC细胞中存在高频率的MSI后，又有很多学者在多种肿瘤中发现MSI. MSI作为肿瘤遗传不稳定一个敏感的检测指标已逐渐被大家接受. 在以后的研究中，相继在肺癌，胃癌，白血病^［5-7］等其他肿瘤也发现微卫星不稳定性. Li et al^［8］报道一组100例包括头颈部肿瘤，膀胱肿瘤及肺癌病例，用9个微卫星位点标记物筛选，发现3个及4个核苷酸重复序列更易出现插入或缺失，26例出现至少一个位点的改变. 显示微卫星不稳定性改变可作为肿瘤细胞的克隆标志，运用于肿瘤的检测. 肿瘤常在抑癌基因位点出现染色体基因缺失，表现为等位基因杂合性丢失(loss of heterozygosity)，通过检测分析肿瘤杂合性丢失及其规律，可在染色体一定范围内发现肿瘤的抑癌基因及易感基因^［9］.

大肠癌(colorectal cancer, CRC)是最常见的恶性肿瘤之一. 近年来其发病率呈上升趋势. 环境及遗传因素在其发病过程中起重要作用. 遗传因素导致的大肠癌主要有两种：①家族性大肠腺瘤息肉病(FAP)导致的大肠癌，约占CRC总数1%；②遗传性非息肉病性大肠癌(herediary nonpolyposis colorectal cancer, HNPCC)约占CRC总数的15%～18%，亦有报道占5%左右. HNPCC是一种常染色体显性遗传性疾病，其发病特点是：①早期发生大肠癌；②大肠以外多器官受累. 由于人类面临着癌症的严重威胁. 因此，如何能揭示癌症的内在规律，为临床有效诊治带来希望，一直是医学乃至自然科学的研究热点. 目前研究的进展已达到癌症细胞核内DNA链上核苷酸排列顺序所形成的基因水平上，人们希望能从基因角度发现癌细胞生长、分裂、侵袭、转移等生物学行为的机制，因此，对于有基因异常的肿瘤，即具有遗传背景的肿瘤即成为研究的重点，而人类的FAP及HNPCC也就自然成了关注的中心.

目前已发现RER⁺肿瘤主要有3类：①散发性结直肠癌，这一类肿瘤细胞核型为近二倍体，患者预后较好；②HNPCC患者发生的结直肠癌、子宫内膜癌以及卵巢癌，这一类肿瘤几乎都表现为MSI，与散发性结直肠癌比较，发病年龄较早；③包括肺癌、乳腺癌和胰腺癌在内的其他肿瘤，这一类肿瘤MSI发生频率相对较低. 近年来研究证实RER⁺是HNPCC、肺癌、乳腺癌、食管癌、膀胱癌的早期分子标志，也是慢性髓细胞性白血病的晚期分子标志，对肾母细胞瘤来说，不仅是晚期分子标志并与其恶性程度有关，对胃癌来说，不仅是其早期事件，而且与癌的恶性转移有一定联系. 并发现MSI存在于病理证实为阴性的肿瘤旁切缘组织. 癌前肿瘤的发生往往在经历一个由正常变化原位癌浸润癌转移癌多阶段的动态发展过程，单一位点的突变不足以引起这一系列的改变. 另外发生突变的细胞尚需一个克隆选择的过程. 因此一个正常细胞由开始突变到发展成为临床上可检测的肿块仍然是一个罕见事件. 有人估计在25%～50%的结肠癌存在9个以上位点的突变. 自然状态下，存在于体细胞的自发突变频率(1.4×10^-10)是不足以达到形成肿瘤发生所需要的如此之多的突变. 肿瘤中突变频率升高可能有以下几个方面的原因：首先某些致癌基因可能以极高的频率发生突变. 在很多基因已发现突变热点，这些部位的突变频率比基因组的其他部位高10¹⁰以上；其次，单一的致突变事件可能引起多位点的改变并使抑瘤基因在内的一系列临近的基因失活. 多位点的改变包括基因的扩增、易位和染色体丢失；再次，导致肿瘤的突变可能在多位点发生，最后突变可赋予细胞选择生长优势. 在每一次突变之后，突变细胞群体持续扩增，为下轮致突变事件提供克隆性的靶细胞群体，通过后一种机制，正常突变频率在细胞的一生中可以提供4～5次突变，这是肿瘤细胞突变频率增高的主要因素. 由此可见，及早检测到体细胞的突变及数目是预测肿瘤发生的良好途径，而MSI正是目前检测基因突变的简便方法. 与目前临床采用的肿瘤诊断手段比较，内微镜及影象学费时费力，有创伤及痛苦，患者不易接受. 与细胞学、病理学、分子生物学其他方法比较，MSI操作简便、成本低廉，而且对于亚临床癌变，就可达到早期发现，是目前其他手段都难以达到的.

到目前为止，人们研究MSI主要集中在人的FAP及HNPCC，而该文作者则对非FAP及非HNPCC的大肠癌进行了MSI的检测，为全面认识大肠癌的MSI提供了线索. 目前已经知道，RFR⁺大肠癌有以下特性：①发病年龄早，35岁以下大肠癌患者RER阳性比例最高；②多位于右半结肠，易发生肠内或肠外其他器官的多发性肿瘤，多发性肿瘤RER阳性率(80%)明显高于单发性肿瘤(11%)，术后易再发其他原发恶性肿瘤；③DNA多为二倍体或近二倍体；④对某些化疗药物(如顺铂)有原发耐药性；⑤具有高突变特性，许多癌基因及抑癌基因(如ras, p53, apc等)突变数目明显增多；⑥粘液腺癌多见，组织分化差，多浸润生长，肿块较大，但较少发生淋巴结转移，预后较好，而RER-的大肠癌多发生在左半结肠，多为多倍体. 晚期胃癌、远端胃癌多为RER⁺，RER⁺表型在肠型和实体瘤中的频率显著高于印戒细胞癌；近端胃癌早期多为RER^-. 这说明与RER⁺癌发病机制不同. 因此，检测不同肿瘤的MSI，对深入认识肿瘤病的基因变化是十分有帮助的. 目前，需大力开展对人体多种肿瘤MSI的检测，了解各种肿瘤与MMR基因突变的关系，弄清肿瘤中MMR基因的突变类型及作用方式，建立更为简便的基因突变的检查技术并应用于临床.

微卫星不稳定性的研究方法，目前主要以PCR技术为基础研究微卫星不稳定性改变，步骤为：①首先需确定特定染色体上特定微卫星位点标记，并根据其序列合成特异性引物. 引物序列一般可根据特定位点直接从基因库中查询. ②收集肿瘤组织及相应正常组织标本、酚、氯仿抽提，乙醇沉淀，提取基因组DNA. ③PCR扩增. ④扩增产物的检测. 常用凝胶电泳，溴化乙锭染色后在紫外灯下观察，或放射自显影及银染等方法观察. ⑤判断结果. 若肿瘤组织较正常对照组织出现某一基因条带消失或密度减少50%以上，可判断为杂和性丢失；若肿瘤组织出现基因条带的增多，即判断为不稳定性改变^{［10，11］}. MSI在人体肿瘤中的研究，国外文献虽然不少，但国内也已有一些关于MSI检测的报道^［12-16］. 其中都有检测方法的介绍，尤其是特异性引物的说明，不知何故，原文未予说明，有些遗憾.

存在的问题：通过对人体多种肿瘤MSI的检测，目前已初步对体细胞中MMR 系统的功能以及MMR 缺陷与肿瘤发生的相应关系有所认识，但此仅仅是深入研究的开始而已，因为①人类MMR基因不仅具有识别和修复DNA复制过程中出现的DMA错配的功能，有实验报道，该组基因还以某种方式参与细胞对增殖的调控，其确切机制及调节方式有待进一步<