中国图书资料分类号R318.14

Subject headingsartificial liver; liver failure; hepatocytes; cell, cultured

众所周知，急性肝功能衰竭死亡率很高，严重危害人类的身体健康，1990年美国因肝衰死亡达27000人，其中10%为急性可逆性肝衰.我国每年死于急性肝衰的人数远大于此，传统的内科治疗仅20%有效，近年来虽有用肝移植治疗急性肝衰，存活率提高55%～75%，但因其供肝来源、免疫排斥、经费等问题使该治疗方法受到限制.人工肝支持系统的研究，无疑为肝功衰竭的支持提供了一条崭新的途径.

自1958年Kiley首先报道应用血液透析法治疗肝功衰竭以来，人工肝的研究历经40⁺a，从人工合成肝辅助装置(血液透析、活性炭、离子交换树脂灌注)，生物肝辅助装置(同种异体肝体外灌注、同种异种间交叉循环、血置换)，发展到目前由人工合成材料和生物材料相结合的组合型生物人工肝支持系统(Hybrid bioartificial liver Support System, HBLSS).该系统突出之处在于将肝细胞体外培养系统用于人工肝，使之具备更充足、完备的肝功能效果，优于传统的人工肝，即参于糖、蛋白、脂肪三大代谢；完成中间代谢；清除毒素和中间代谢产物；具有生物合成、转化功能；分泌具有促进肝细胞生长的活性物质等特异性肝功能.

该装置在一些国家已完成动物实验阶段进入Ⅰ期临床试验，均获得良好效果.

1HBLSS基本原理

是将培养增殖的肝细胞置于体外循环装置中，即生物反应器中.患者的血液(血浆)流过生物反应器时，通过容器内纤维素半透膜与培养肝细胞间进行物质交换，从而达到人工肝支持作用.

2肝细胞获取

维持机体正常肝功能运转至少需要30%的肝量，1987年Matsmura认为以正常的成人肝重为1200g计算，制备一个具有相似功能的生物人工肝至少需要25g～27g肝细胞，相当于1.9×10⁹～5.6×10⁹个肝细胞^［1］.肝细胞不易在体外培养生长，在普通条件下，12h～24h丧失其间隙连结构性，3d～5d细胞呈扁平状，失去其特异组织功能，1wk～2wk全部死亡^［2］.因此不断改善体外培养条件，使肝细胞数量上、质量上满足HBLSS的需要.

2.1肝细胞来源HBLSS的肝细胞来源于原代肝细胞和肝细胞系.

2.1.1肝细胞系肝细胞系在体外培养时，可无限增殖，易达到足够的数量的活力，高分化肝细胞更保持正常肝细胞许多特性，具备肝的特异性功能^［3］，但存在的问题是：肝细胞系通常来源于肝脏肿瘤，如C3A来自肝母细胞瘤，CLI来自高分化肝癌，故在应用时，可能将肿瘤因素带入体内，在这方面尚需进一步研究.

应用C3A细胞在中空纤维中高密度培养，类肝细胞总量可达200g，成功地进行肝衰动物模型和临床治疗试验^［4］.

2.1.2同种肝细胞胎肝细胞，特别是较大月龄者分离的胎肝细胞，免疫原性弱，组织分化功能强，可以在体外继续分化增殖.此外，成人肝细胞也可获取，每克肝组织均获1.53±0.59×10⁷个肝细胞，数量上不能满足治疗需要，且来源受限.

2.1.3异种肝细胞应用猪、兔肝细胞，每克肝细胞均可分离约2.7±0.48×10⁷个肝细胞，普通培养条件，来源丰富，但存活时间仅3d～5d，限制了临床应用.

3肝细胞的培养

肝细胞在体外培养存活时间短，难以满足临床应用需要，但通过体外培养可以研究其特殊培养的条件和方法，可获得较长期存活又保持其活力的肝细胞.

3.1肝细胞单层培养肝细胞培养中，加用一些基质如聚乙酰内脂(Poly-N-P-Uinybenzyl-D-Lactomide)、胶原等可以延长肝细胞寿命，有利于长期保持其活力和功能，Hase报道了在200个胶原包裹玻璃平板上培养了6×10⁹个肝细胞，分泌清蛋白、尿素及糖原合成功能可维持2wk^［5］. dunn在胶原三明治型培养大鼠肝细胞可保持其正常形态和清蛋白合成等肝特异功能42d^［6］，使用基质进行单层肝细胞的培养应用于HBLSS缺点在于：这种系统要很大方能容纳足够数量的肝细胞，以满足实验和临床应用.

3.2肝细胞球形聚集培养，又称球体培养技术(Sphenods)

普通的培养方法仅能给肝细胞提供二维生长的表面，这将限制肝细胞的功能分化和生长调节.在体内肝细胞是处于一种三维环境中，细胞间相互作用能调节细胞生长的功能.1984年，Landry应用旋转培养仪，将具有相互聚集倾向的肝细胞在蛋白烯糖类基质作用下，结果80%～90%自动形成球形的肝细胞^［7］.其原理是蛋白烯糖的电荷密度较高，与肝细胞表面电荷起作用，阻止肝细胞在培养表面铺展，这种球形肝细胞聚集细胞数量多，维持肝细胞活力和功能与普通培养基相似.但问题在于过大的球形聚集使肝细胞中心的细胞处于营养不良和缺氧环境而衰老死亡.

3.3肝细胞微载体培养1967年，Van Wezel首次应用微载体技术，该技术最大优点在于可增大培养面积(1g葡聚糖微载体的表面积是0.6m²).微载体大量的表面积及面积——容量关系特别适合于在有限的培养体积内粘附大量的肝细胞.使用胶原被覆和微载体，培养肝细胞可延长肝细胞的寿命达1wk，并维持其特异性功能^［8］，在体内动物实验中，在先天性代谢性肝病和高胆红素Gunn大鼠和清蛋白缺乏症的Magase大鼠均有明显疗效.在90%肝切除大鼠肝衰模型中，微载体粘附肝细胞可显著提高其生存率^［8，9］.1992年，Dixit研究生物修饰的多聚羟甲基丙烯酸树脂(HEMA)微载体用于高密度培养肝细胞移植的实验中保持良好的肝特异性代谢功能^［10］.

3.4肝细胞微载体灌注式培养在实验条件中，Bellco搅拌培养瓶获得肝细胞微载体培养，获得细胞总量为2×10⁸水平，尚难达到HBLSS要求.若要获得25g～75g(2.5×10⁸个～7.5×10⁸个)，则需要通过微载体的灌注式培养^{［11，12］}，在灌注式培养系统中，细胞生长环境内监测及调节均由计算机自动控制，细胞密度可达2～5×10⁷，且培养容积可增大为几升至几十升，满足HBLSS的需要.

3.5肝细胞微囊包裹微囊是一种人工合成的多聚结构，由超薄半透膜作为肝细胞外壳，囊内可容纳各种培养、繁殖的肝细胞，囊膜外表可防止肝细胞逸出导致免疫反应，但囊膜可使肝细胞——血循环间物质交换自由进行，对抗血循内的白细胞、抗体进入囊内损害肝细胞^［13］.肝细胞与胶原基质微囊形成三维结构，利用细胞间的相互作用维持肝细胞正常功能，这种微囊肝细胞可维持6wk～8wk的功能.动物实验，每月一次微囊肝细胞移植可使Gunn大鼠胆红素下降，维持低水平^［14］.

4肝细胞的储存

应用HBLSS已在动物实验和有限的临床实验中获得良好的效果，成为有前途的肝病治疗途径.应用低温储存技术建立实用可靠的肝细胞库，使患者随时都能得到高活率、有功能的肝细胞，利于推广HBLSS.目前较好的肝细胞低温保存液仍为肝器官保护液——UW液，但该液较昂贵，长期储存效果欠理想^［15］.有报道应用低剂量的二甲硫砜防止脂质过氧化，加氨基酸，调节蛋白，能较长期保持肝细胞组织转导蛋白合成，功能达96h^［16］.

5中空纤维培养系统

5.1中空纤维装置1976年，Wolf最早提出毛细中空纤维肝细胞反应器，该装置含有多个平行排列于一圆柱形外壳内的半透膜纤维管，按功能分为两个独立的腔：纤维管内腔及纤维管和外壳间的外腔，两部分通过中空纤维壁上直径为0.2μm的微孔进行物质的顺浓度梯度交换，纤维管壁上微孔可限制大分子物质通过，而清蛋白等一些小分子物质可顺利通过，起到了半透膜作用.一般而言，中空纤维分子截流量为65KD～100KD，在使用中空纤维高密度培养肝细胞作为HBLSS时，培养的肝细胞可通过中空纤维管与宿主的免疫系统相隔离，从而免受宿主免疫系统的影响.

5.2中空纤维肝细胞系培养系统将肝细胞置于中空系统外腔培养，其中植入的C3A肝细胞系是一稳定的分化良好的肝母细胞，可高密度生长，提供大量类肝细胞，实验表明；它对醋氯酚诱发的狗的暴发性肝衰有治疗作用，临床曾治疗一例急性肝衰昏迷患者，1h意识恢复，停止使用人工肝辅助.

5.3中空纤维——微载体肝细胞系统1990年，Arnauct在中空纤维外腔植入微载体粘附肝细胞，实验证明对暴发性肝衰和慢性先天性代谢性肝病的动物模型均有肝辅助作用^［17］.他们使用冻存的微载体粘附肝细胞救活10例暴发性肝衰患者，明显改善患者生存率.

5.4中空纤维——微囊肝细胞系统1989年，Yamamoto et al在中空纤维内腔内种植微囊肝细胞. 动物实验表明此种HBLSS也能改善暴发性肝衰的动物模型的生存期，但是没有临床研究报道.

6复合式中空纤维装置

1994年，Dixit研究了一种新的中空纤维装置，将两种不同的中空纤维管置于同一多聚碳酸盐外壳内，其中一种由多聚砜制成，孔径为2μm，并<