中国图书资料分类号R735.7

摘要

目的研究常用化疗药物对人肝癌细胞SMMC-7721端粒酶活性的影响.

方法利用端粒重复扩增实验(TRAP)结合非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染法，测定SMMC-7721细胞经过几种化疗药物(顺铂、阿霉素、丝裂霉素、5-FU)不同浓度和时间作用后端粒酶活性的变化.

结果当各种药物大剂量处理细胞4h后再祛除药物培养20h后，顺铂对酶的活性完全抑制，丝裂霉素有部分抑制，阿霉素和5-FU无抑制作用；而未经20h再培养则无作用；小剂量药物处理细胞5d，其结果同大剂量相似.

结论顺铂和丝裂霉素对人肝癌SMMC-7721细胞端粒酶活性有抑制作用，可能与药物的作用机制有关.

Inhibition of telomerase activity of human liver cancer cell SMMC-7721 by chemotherapeutic drugs

MENG Zhi-Qiang, YU Er-Xin and SONG Ming-Zhi

Cancer Hospital of Shanghai Medical University, Shanghai 200032, China

Subject headingsliver neoplasms/drug therapy; telomerase; cisplatin; mitomycin c

bstract

AIMTo investigate the inhibition of telomerase activity by several chemotherapeutic drugs regularly used in liver cancer treatment.

METHODSBy using telomerase repeat amplification protocol (TRAP) combined with PAGE silver staining, we detected the changing of telomerase activity of human liver cancer cell line SMMC-7721 by cisplatin, 5-FU, doxorubicin, mitomycin C in different doses and different periods.

RESULTSIn high doses, no inhibition of tolemerase activity was found when cells were collected after only 4 hours of drug treatment, but the telomerase activity of cells was completely inhibited by cisplatin and partly inhibited by mitomycin C when the drug was removed and cells recultured for 20 hours. However, doxorubicin and 5-FU had no effect.In low doses,the effects were similar.

CONCLUSIONCisplatin and mitomycin C can inhibit telomerase activity of human liver cancer SMMC-7721 cell, which maybe correlates with their anti-cancer mechanism.

0引言

端粒(telomeric)是真核动物细胞染色体末端的一个特殊结构，它是由TTAGGG六个碱基的重复序列组成，有稳定染色体，固定染色体在细胞内位置的作用，并参与DNA的复制. 端粒的重复序列在每次细胞分裂后都要缩短，这是因为DNA聚合酶不能复制DNA最末端的一部分(末端复制). 不完全复制将传给子代细胞，当端粒的长度缩短到一定程度时，细胞停止分裂进入衰老. 而肿瘤细胞能摆脱衰老的表型变为不死时，往往伴随着端粒酶(telomerase，一种能在染色体末端合成新端粒序列的核糖核蛋白)的活化或功能的上调. 大多数的研究发现人类肿瘤含有端粒酶的活性，这些肿瘤缺乏调节端粒酶的机制，不能下调端粒酶活性使细胞停止分裂和退出细胞周期^［1］. 端粒酶活性的调节可能是肿瘤治疗作用机制的一部分. 我们采用TRAP方法观察了几种在肝癌治疗中常用的化疗药物对SMMC-7721人肝癌细胞端粒酶活性的影响.

1材料和方法

1.1材料人肝癌细胞株SMMC-7721由上海医科大学中山医院中心实验室赠送；阿霉素为深圳万乐制药公司产品，顺铂为澳大利亚F.H. Faulding公司产品，5-FU为上海旭东海普药业公司产品，丝裂霉素为日本协和制药产品；所用PCR仪为美国GeneAmp^ PCR 7500，分光光度计为Beckman DU640；分子量标记物为pBR322/HaeⅢ markers.

1.2细胞处理人肝癌SMMC-7721细胞培养于RPMI1640培养液(Gibco产品，含100mL/L小牛血清)，37℃，50mL/L CO₂. 用MTT法测定化疗药对细胞的生长抑制率，其d5的IC₅₀分别为：顺铂为5μmol/L，阿霉素为1μmol/L，5-FU为54μmol/L，丝裂霉素为0.19μmol/L. 在处理细胞时我们使用两种浓度，一是IC₅₀浓度，二是致死剂量(顺铂200μmol/L，阿霉素为50μmol/L，5-FU为2mmol/L，丝裂霉素为10μmol/L). 使用前2.5g/L的胰酶消化记数，取1×10⁶接种于新培养瓶内(25mL培养瓶，4mL培养液)，预培养24h后，换新培养液并加入药物. 细胞处理的时间为：高浓度为药物作用4h后收集细胞；另外4h后祛除药物再培养20h收集细胞；低浓度时为药物作用5d后收集细胞. 细胞收集方法为：记数6×10⁵细胞，冰冷PBS洗3遍后，放置Eppendorf管内准备端粒酶的抽提.

1.3端粒酶的抽提在放置细胞的Eppendorf管内加入CHAPS(3-［(3-胆酰胺丙基)-二乙铵］-丙磺酸)缓冲液200μL(10mmol/L Tris-HCl， pH 7.5，1mmol/L MgCl₂，1mmol/L EGTA， 0.1mmol/L Benzamidine, 5mmol/L-β巯基乙醇，0.5% CHAPS和100mL/L甘油)，冰浴30min后，14000g 4℃离心30min，吸取上清，速冻于-70℃低温冰箱.

1.4TRAP方法测定端粒酶活性①蛋白定量：采用考马斯亮蓝G-250染色法对抽提的产物进行蛋白定量，将蛋白的浓度稀释至1g/L，以便使TRAP分析时保持在同一水平. ②端粒酶活性测定：采用Oncor公司的TRAP-eze^TM端粒酶检测试剂盒. 在50μL PCR总反应体积中加入：10×buffer 5μL，50×dNTP，TS primer, TRAP, primer mix各1μL，Taq酶2U，端粒酶抽提物2μL. 30℃温育30min后，按94℃ 30s，60℃ 30s程序PCR扩增35个循环. ③TRAP产物的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染分析：将PCR的产物25μL进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电压200V，缓冲液为0.5×TBE，电泳至溴酚蓝到达凝胶底部为止，取出凝胶进行银染，步骤：将凝胶在双蒸水中漂洗后，100mL/L乙醇固定10min，1%硝酸脱色10min，0.2%硝酸银染色15min，然后用30g/L的无水碳酸钠(每升含甲醛1mL，10g/L Na₂S₂O₃ 100μL)显色至所需条带出现而背景不至于过深为至. 各步骤之间均用双蒸水漂洗2～3遍. 显色完毕后用100mL/L乙醇固定，拍照. 端粒酶凝胶电泳的阳性结果为有间隔6个碱基对的阶梯状条带的出现.

2结果

当高浓度时，在细胞经过4h药物处理后即刻收集细胞的测定结果显示，各药物均未对细胞端粒酶活性产生抑制；在细胞经过4h药物处理后祛除药物再培养20h的端粒酶活性测定结果显示，顺铂表现出对端粒酶活性的完全抑制，丝裂霉素有一定程度的抑制，而阿霉素和5-FU未有抑制作用(图1). 当低浓度时，细胞经过5d的药物处理，顺铂和丝裂霉素均有中等程度的抑制作用，和高浓度一样，阿霉素和5-FU无抑制作用(图2).

图11 marker2 阳性对照3 顺铂5 丝裂霉素7 5-FU9 阿霉素处理4h，4， 6， 8， 10分别为相应药物祛除药物后再培养20h.

图21 阿霉素2 顺铂3 丝裂霉素4 5-FU药物处理5d.

3讨论

在肝癌的化疗中，常用的药物为顺铂、丝裂霉素、5-FU、阿霉素、吡喃阿霉素等. 我们采用在肝癌治疗中常用的几种化疗药物，通过处理人肝癌细胞SMMC-7721，观察了对细胞端粒酶活性的影响，探讨化疗的治疗作用与端粒酶活性抑制的关系. 结果说明在这几种药物中，顺铂和丝裂霉素对端粒酶活性有抑制作用，不管在大剂量还是小剂量时，尤其顺铂的作用更加明显，顺铂大剂量处理4h祛除药物再培养20h后，细胞端粒酶活性完全抑制. 而阿霉素和5-FU无论大剂量还是小剂量均无抑制作用. 在国外的相似的研究中，Burger et al^［2］在用睾丸癌细胞的研究中发现，顺铂对肿瘤细胞的端粒酶活性有抑制作用，而阿霉素、博来霉素、马法兰、甲氨喋呤则无作用. 作者认为顺铂的抑制作用是由于此药物进入细胞后和DNA连接，且连接的方式为G-Pt-G的形式，而端粒和端粒酶RNA复合物hTR也是富含G的，此为抑制端粒酶活性的可能机制，本结果可能亦与此机制有关. 在实验中，细胞经过处理4h未经20h再培养无酶活性的抑制，而经过20h再培养的酶的活性才受到抑制，这说明端粒酶活性抑制的表现可能是一个时间依赖的过程. 另外的作者^［3］在用鼻咽癌细胞做的研究说明泰素、长春花碱、甲氨喋呤、5-FU、顺铂、阿霉素、鬼臼乙叉甙(Vp-16)等对端粒酶活性均无影响. 不同的结果可能与研究中使用的细胞株有关. 有关丝裂霉素对端粒酶作用的研究尚未见到报道，我们发现丝裂霉素对肝癌SMMC-7721端粒酶活性有抑制作用，丝裂霉素的抗肿瘤作用类似于烷化剂的方式，一是和DNA交叉连接，破坏DNA，可能破坏的部位与端粒酶的调节基因有关；另外，丝裂霉素还可和RNA以及蛋白质结合，并能产<