中国图书资料分类号R575

Subject headingsliver cirrhosis/therapy; liver cirrhosis/pathology; liver cirrhosis, expremental/therapy; tetrandrine/therapeutic use

汉防己甲素(又称粉防己碱;Tetrandrine; Tet)是从防己科千金藤属植物粉防己(stephania tetrandra S. Moore)的块根中分离出的主要生物碱，其分子式为C₃₃H₄₂N₂O₆ ，化学结构属于双苄基异喹啉类. 现代药理研究证实，Tet是一种钙离子拮抗剂，主要作用于钙离子通道，影响钙离子的跨膜转运以及在细胞内的分布利用. 近年来,Tet对肝纤维化的防治作用已渐渐为人们所重视. 随着肝脏细胞分离培养技术的建立及分子生物学技术的进步，Tet抗肝纤维化的研究已深入到细胞、亚细胞及分子水平. 本文就近年来的有关研究作一综述.

1Tet对大鼠实验性肝纤维化的影响

用四氯化碳(CCl₄)诱导大鼠肝纤维化模型，研究Tet对实验性肝纤维化的防治作用. 结果显示各期治疗组大鼠肝组织及血清透明质酸(hyaluronic acid, HA)含量、血清谷丙转氨酶活性(ALT)均低于模型对照组(P＜0.01). 3wk时治疗组大鼠肝脏细胞变性、坏死及炎细胞浸润程度均显著低于模型对照组. 12wk时模型对照组成纤维细胞增生达2.8级，HE及VG染色均示假小叶形成；而治疗组虽有成纤维细胞及胶原增生，但肝小叶形态完整. 表明Tet能显著改善肝功能，减轻肝脏病理损害程度，抑制肝脏细胞外基质形成^［1］. Tet能抑制肝纤维化大鼠肝组织中储脂细胞(Ito细胞)的增殖转化，使Ⅳ型胶原沉积减少，结蛋白阳性细胞数显著少于生理盐水对照组(P＜0.01). Tet治疗组的Ito细胞数量及Ito细胞和粗面内质网平均面积也较生理盐水对照组减少(P＜0.05)^［2,3］. 在肝硬变门脉高压大鼠中，Tet可使肝细胞损害减轻，肝内纤维组织减少，ALT、碱性磷酸酶(ALP)和血清总胆红素(STB)降至正常^［4］. Tet也可降低门脉高压大鼠的门静脉压力和平均动脉压^［5］. Tet对血清Ⅲ型前胶原肽(procollagen Ⅲ peptide, PⅢP)、HA和肝内炎症等均有明显抑制作用，与传统抗纤维化药物秋水仙碱的效果接近；对Ito细胞的增殖转化及胶原沉积的抑制则优于秋水仙碱，且该药无明显毒副作用^［6］.

2Tet抗肝纤维化的细胞学研究

肝纤维化系由肝结缔组织弥漫增生所致，是多种慢性肝病发展成肝硬变的渐进过程. 参与肝纤维化形成的细胞主要有成纤维细胞、Ito细胞、免疫活性细胞、肝细胞、内皮细胞及库普弗细胞等. 这些细胞分泌产生胶原等过多的细胞外基质，与细胞成分共同在肝脏内沉积，导致肝纤维化.

2.1Tet对成纤维细胞生长增殖的影响成纤维细胞能大量合成和分泌胶原蛋白、纤维连接蛋白(fibronectin, FN)、HA及层连蛋白(laminin, LN)等结缔组织接地基质成分. 因此，它的生长增殖对肝纤维化的形成具有不可忽视的作用. 采用流式细胞术观察不同浓度的Tet(10，20，30，40，50，60μg/mL)对₃T₆成纤维细胞生长增殖的影响，结果表明Tet能显著延缓细胞G1-S期的进程，抑制S期DNA的含量而增加G1和G2期蛋白质的含量，使细胞呈现不平衡生长直至死亡. 此作用具有一定的量效关系. 加入外源性的Ca²⁺及ATP证明，Tet对成纤维细胞生长增殖的作用与阻断Ca²⁺内流无关^［7，8］. 也有研究报道，Tet(1.0μg/mL)阻止细胞由G1期进入S期，Tet(1.5，2.0μg/mL)则能显著增加₃T₆细胞G2+M期细胞，降低细胞RNA含量，增加细胞蛋白质含量，但DNA含量不变，使细胞不平衡生长，从而对其增殖产生剂量依赖性的抑制作用^［9］. 以³H-脯氨酸掺入量及掺入抑制率为指标，观察Tet对₃T₆成纤维细胞增殖及胶原合成的影响，结果表明，10μg/mL～50μg/mL浓度范围内，Tet能显著抑制₃T₆成纤维细胞的胶原合成，此抑制作用与浓度成正相关. 倒置显微镜下观察发现细胞生长良好，无明显形态改变，表明Tet对细胞增殖及胶原合成的抑制作用非直接杀伤作用，而是在分子水平上起作用^［10］. Tet也可浓度依赖性地抑制人胚肺成纤维细胞的增殖及胶原合成，抑制率随时间延长而升高.

2.2Tet对肝细胞生长增殖的影响肝细胞为肝脏的实质细胞，占肝脏90%以上，既能合成Ⅰ，Ⅳ型胶原，又能合成硫酸软骨素及HA等基质. 在生理条件下，其胶原合成很少，但在某些病理条件下其合成胶原的能力明显增强. 在体外培养的肝细胞中直接加入CCl₄造成损伤模型，观察细胞膜流动性及细胞内Ca²⁺浓度. 结果表明Tet可明显抑制CCl₄引起的肝细胞存活率降低和乳酸脱氢酶的释放，稳定Ca²⁺浓度，保持细胞膜流动性，具有保护肝细胞的作用^［11］. 采用流式细胞技术检测不同浓度的Tet对大鼠RBL肝细胞生长增殖的影响. 结果显示随着Tet浓度的增加(10，20，30，40，50，60μg/mL)，G1-S期的进程加速，且S期DNA含量及G1和G2期蛋白质含量均增加，呈正量效关系. 经加入外源性Ca²⁺及ATP证明Tet促进肝细胞生长增殖的作用与阻断Ca²⁺内流无关. 结果提示具有钙通道阻断作用的Tet可促进肝细胞生长增殖^［12］. 但也有研究得出不同结论^［10,13］. 以³H-胸腺嘧啶(³H-TdR)、³H-脯氨酸掺入量及掺入抑制率为指标，研究Tet对人胎肝细胞及大鼠肝细胞DNA及胶原合成的影响. 结果显示10μg/mL～50μg/mL浓度范围内，Tet能明显抑制两种细胞DNA及胶原合成，抑制程度与浓度呈正相关.

2.3Tet对Ito细胞生长增殖的影响Ito细胞位于肝窦周围间隙内，其功能是储存脂肪和维生素A. 此外还可产生结缔组织和基质. 现在认为Ito细胞是肝小叶内一种相对不活动的成纤维细胞，在一定的条件下可转化为成纤维细胞，在肝硬变的发生发展中具有重要作用. 它是正常及肝纤维化时产生胶原的主要细胞. 在CCl₄诱导的大鼠肝纤维化模型中，Tet能明显抑制肝组织中Ito细胞的增殖及转化^［2，6］. 体外培养的Ito细胞中加入Tet后，其DNA及胶原合成显著受抑，抑制程度与Tet浓度及作用时间成正相关. Tet还可阻断血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor; PDGF)的促Ito细胞增殖及胶原合成作用. 结果提示Tet除直接作用外，还通过抑制PDGF的作用而起到间接的抗肝纤维化作用^［14］.

3Tet抗肝纤维化的亚细胞学研究

肝实质细胞富含线粒体(mitochondria, Mc)、微粒体(microsome, Ms)、溶酶体(lysosome, Ls)等细胞器. 研究表明，Mc和Ms的作用不再限于能量代谢与蛋白质合成，它们还参与调节胞质游离Ca²⁺的浓度，其对Ca²⁺“封闭”作用的丧失是导致细胞损伤、死亡的重要原因，而持续的肝损伤往往会导致肝纤维化. Mc中的单胺氧化酶(monoamine oxidase; MAO)是参与胶原合成代谢的酶，血清中MAO活性升高是反映肝纤维化形成的灵敏指标. N-乙酰-β-氨基葡糖苷酶(N-acetyl-β-D-glucosaminidase, NAG)则广泛分布于Mc，因参与基质蛋白多糖分解而与肝纤维化有关. 血清中NAG活力升高，表明基质的合成分解均很活跃. 在CCl₄-诱导大鼠模型中的实验说明小剂量Tet能明显降低Mc的MAC和NAG活性；增加Mc对Ca²⁺的主动摄取，减少其被动释放；增加Mc内膜表层和脂双层中心处的流动性及巯基含量(SH)^{［10，11］}. 结果提示小剂量Tet具有良好的Mc保护和抗纤维化作用. Tet也可增加Ms中的SH含量，降低MS的NAG活性，增加Ms的标志酶-葡萄糖-6、磷酸酶-的活性，对Ms具有良好的保护作用.

4Tet抗肝纤维化的分子生物学研究

体外培养的₃T₆细胞中，以cDNA为探针进行核酸分子杂交^［15］. 结果显示Tet能显著降低₃T₆细胞Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ型前胶原mRNA水平(P＜0.05～0.01). 在CCl₄大鼠肝纤维化模型中，Tet早期治疗组显著降低了Ⅰ,Ⅲ,Ⅳ型前胶原mRNA水平(P＜0.05～0.01)，提示Tet对Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ型胶原基因的表达具有抑制作用是在转录水平上^［16］. Tet亦可降低肝纤维化时PDGF,PDGF受体β(platelet-derived growth factor receptor, PDGFRβ)及转化生长因子β₁(tansforming growth factor, TGFβ₁)的mRNA表达水平，提示Tet可能通过抑制TGFβ₁，PDGF等肝纤维化相关生长因子的表达而间接抑制胶原合成^{［17，18］}.

5Tet治疗肝硬变和慢性肝病临床观察

33例肝硬变患者口服Tet 3mo后，其静脉色氨酸耐量试验明显改善；服药18mo后，血清Ⅲ型前胶原肽(procollagen Ⅲ peptide, PⅢP)含量显著下降(P＜0.01)^［19］. 54例肝硬变患者口服Tet治疗后，随访18mo，结果血清HA，PⅢP、肝组织Ⅰ，Ⅲ型胶原与治疗前相比有显著差异(P＜0.05～0.01). 与用肝泰乐治疗的对照组比较也有统计学意义(P＜0.01). Tet治疗组患者肝肾功能也有不同程度改善^［20］. 115例慢性肝病患者口服Tet治疗后随访6mo，结果发现：血清HA，PⅢP含量较治疗前显著降低(P＜0.01)；14例(15.4%)肝纤维化消失，54例(58.1%)胶原纤维沉积明显减轻，19例(20.4%)胶原纤维轻度减轻；炎细胞浸润明显减轻或消失，Ito细胞数量减少，与肝泰乐对照组相比有显著差异(P＜0.