¹Department of Gastroenterology and ³Pathology, Fuzhou General Hospital of Chinese PLA, Nanjing Military Command Area, Fuzhou 350025, Fujian Province, China

²Department of Gastroenterology, Chinese PLA 163 Hospital, Changsha 410000, Hunan Province, China

Subject headingsliver cirrhosis, experiment/pathology; ascites/pathology; enkephalin, leucine/blood; β-endorphine/blood; dynophine/blood

Abstract

AIMTo assess the role of endogenous opioid peptides in experimental cirrhosis and ascites formation in rats.

METHODSLeucine enkephalin (L-ENK), β-endorphine (β-EP) and dynorphine A_1-13 (DynA_1-13) were measured by using radioimmunoassay in carefully collected plasma samples from 20 healthy rats and 37 cirrhosic (17 with ascites) rats induced by carbon tetrachloride and phenobarbital.

RESULTSPlasma L-ENK increased markedly in two groups of cirrhosis rats compared with these of healthy controls (P＜0.01，P＜0.01，respectively). The increase in plasma L-ENK was proportional to the degrees of liver damage as judged in the experimental cirrhotis in rats with or without ascites, and both were the positively correlated with prothrombin time (PT) (r=0.68, P＜0.01; r=0.69, P＜0.01) and negatively correlated with plasma albumin (r=-0.69，P＜0.01; r=-0.56，P＜0.01). DynA_1-13 was also significantly higher than those of healthy controls (P＜0.01, P＜0.01, respectively). And it was positively correlated with PT (r=0.65，P＜0.01; r=0.67，P＜0.01)and inversely correlated with plasma albumin (r=-0.64，P＜0.01; r=-0.59，P＜0.01). In addition, althongh L-ENK was directly correlated with DynA_1-13 in the two groups of cirrhosis r=0.61，P＜0.01; r=0.76，P＜0.01), there was no significant difference of β-EP.

CONCLUSIONThe increase in plasma L-ENK and DynA_1-13, mainly caused by diminished hepatic inactivation, can attribute ascites formation in experimental cirrhosis in rats. The liver may play an important role in the elimination of low molecular opioid peptides such as L-ENK and DynA_1-13, but not the high molealar peptides such as β-EP.

中国图书资料分类号R 575.202.1

摘要

目的探讨血浆内源性阿片肽(Eop)在实验性肝硬变及腹水形成过程中的变化的意义.

方法应用放射免疫法测定正常对照组及CCl₄诱发大鼠肝硬变(n=37)及形成腹水(n=17)过程中血浆3种Eop的含量变化.

结果肝硬变腹水组及肝硬变组血浆亮氨酸脑啡肽(L-ENK)含量均显著高于正常对照组(P均＜0.01)，且都与血清清蛋白浓度呈显著负相关(r=-0.69，P＜0.01; r=-0.56，P＜0.01)；与凝血酶原时间(PT)呈显著正相关(r=0.68，P＜0.01; r=0.69，P＜0.01). 同样两肝硬变组血浆强啡肽(DynA_1-13)含量均显著高于正常对照组(P均＜0.01). 且与血清清蛋白浓度呈显著负相关(r=-0.64，P＜0.01; r=-0.59，P＜0.01)，与PT呈显著正相关(r=0.65，P＜0.01; r=0.67，P＜0.01). 但两肝硬变组血浆L-ENK，DynA_1-13与血ALT不相关. β-内啡肽(β-EP)的血浆含量在两肝硬变组及正常对照组中无显著差异.

结论肝脏灭活功能受损是血浆小分子阿片肽(L-ENK与DynA_1-13)含量升高的重要原因，后者又是实验性肝硬变腹水形成的主要原因之一. 而在β-EP体内灭活过程中，肝脏不起主要作用.

0引言

肝硬变腹水形成的机制已有许多论述，但尚未彻底阐明. 新近提出的外周血管扩张假说认为，肝硬变时首先由于外周动脉扩张而致有效血容量减少，再继发引起的水钠潴留，腹水形成. 我们采用CCl₄等因素共同作用，诱发大鼠肝硬变，并观察肝硬变过程各阶段血浆中具有强烈扩张血管作用的3种内源性阿片肽(Eop)含量的变化，现报道如下.

1材料和方法

1.1材料CCl₄，分析纯，上海长江化工厂产品，批号：940416. 抑肽酶，珠海丽宝生物化学有限公司产品，批号：960101. EDTA-Na₂，分析纯，广东汕头金砂化工厂产品，批号：960606. 神经肽放免药盒，由第二军医大学神经生物学教研室提供. SD大鼠，清洁级，♂，体重175 g±18 g，购于中科院上海实验动物中心.

1.2方法应用多种因素共同作用制备大鼠肝硬变模型：52只大鼠用于肝硬变造模，以每升蒸馏水中含0.35 g苯巴比妥的溶液代替饮用水^［1］，2 wk后按5 mL/ kg体重皮下注射500 mL/ L CCl₄菜籽油溶液，2次/ wk，并以50 mL/ L乙醇溶液为其唯一的饮用水. 正常对照组20只大鼠饲养在同样条件下，蒸馏水为其自始至终唯一饮用水. 注射后9 wk起分批麻醉大鼠(30 g/ L戊巴比妥钠ip)，剖腹，从腹主动脉准确取血5 mL，注入预冷加有0.3 mol/ L EDTA·2Na 100 μL及抑肽酶300 U的塑料指形管中，混匀，迅速低温离心15min(3000 r/ min)，随即分离出血浆，用密封塑料管保存于-20℃低温冰箱中待测. 另抽血4 mL用于检测肝功能及凝血酶原时间(PT). 仔细比较各组大鼠肝脏的外表、形态，用100 mL/ L福尔马林溶液固定肝脏，取材后石蜡包埋、切片、HE染色、光镜检查. 3种Eop均采用放免法测定. 先将标准物或样品与抗血清混匀，进行免疫反应一定时间(4℃，24 h)，使抗原与抗体充分结合，然后再加入标记抗体，与抗体反应(4℃，24 h)，最后分离抗原抗体结合物(B)与游离抗原(F)，沉淀计数是B的每分钟计数(cpm)

统计学处理应用完全随机设计的方差分析及Newman-Keuls法两两比较，直线相关分析.

2结果

2.1肝脏病理组织学经过皮下注射CCl₄后的9 wk～13 wk有37只大鼠发展成肝硬变，其中17只出现腹水. 肉眼见肝脏质地变硬、边缘变钝、表面凹凸不平，布满小结节(图1). 光镜下见正常肝小叶结构被破坏，由广泛增生的纤维组织将原来的肝小叶分割包绕成大小不等、圆形或椭圆形的肝细胞团，即形成假小叶. 假小叶内肝细胞索排列紊乱，不同程度的变性、坏死及增生(图2).

2.2血浆L-ENK，β-EP及DynA_1-13肝硬变腹水组及肝硬变组血浆L-ENK及DynA_1-13均显著高于正常对照组(P＜0.01). 随肝硬变程度加深，两者的血浆含量均呈上升趋势，且相差显著(P＜0.01). 三组间血浆β-EP含量无显著差异. 线性相关分析显示：肝硬变腹水组和肝硬变组血浆L-ENK含量与血清清蛋白浓度均呈显著负相关(r=-0.69，P＜0.01; r=-0.56，P＜0.01)，与PT延长均呈显著正相关(r=0.68，P＜0.01; r=0.69，P＜0.01). 上述两肝硬变组血浆DynA_1-13含量与血清清蛋白浓度均呈显著负相关(r=-0.64，P＜0.01; r=-0.59，P＜0.01)，与PT延长均呈显著正相关(r=0.65，P＜0.01; r=0.67，P＜0.01). 但两肝硬变组血浆L-ENK，DynA_1-13与血ALT都不相关. β-EP的血浆含量在两肝硬变组中无显著差异，且与血清清蛋白、PT，ALT，L-ENK，DynA_1-13之间都无显著相关. 两组肝硬变中血浆L-ENK与DynA_1-13分别呈显著正相关(r=0.61，P＜0.01; r=0.76，P＜0.01).

图1肝硬变大鼠肝脏图2肝硬变大鼠肝脏HE×40

3讨论在肝硬变腹水形成的机制中，目前外周血管扩张理论得到了广泛的支持^［2］. 肝硬变时，首先由于外周动脉扩张引起血管容量增大，有效循环血量相对不足，动脉压下降，这时RAA系统及交感-儿苯酚胺系统必须持续兴奋以维持动脉压稳定，同时产生过多的钠水潴留，导致腹水形成. 强调了周围动脉扩张是肝硬变腹水形成的始动因素. Eop具有强有力扩张血管作用，主要来源于脑、胃肠道、神经末梢及肾上腺，包括有脑啡肽、内啡肽及强啡肽三大类广泛分布体内的数十种具有类似生物活性的物质，它不仅参与机体许多生理功能调节，还与众多疾病的发生有关. 本结果表明，两肝硬变组中血浆L-ENK和DynA_1-13都显著高于正常对照组，而且升高的水平与肝功能受损的程度呈正相关. 而这种现象并非是对疾病的非特异性反应^［3］，也不是从损伤的肝细胞中漏出到体循环，因为肝细胞中Eop含量极微. 交感神经末梢和肾上腺分泌增强并非血Eop升高的唯一途径，因为在双侧肾上腺切除的患者血中Eop都无变化.

在生理状态下，Eop可被一系列组织水解酶快速降解，肝脏富含阿片肽水解酶，在Eop降解过程中起重要作用. 本研究两肝硬变组中血浆L-ENK和DynA_1-13升高的水平<