department of Gastroenterology, Xijing Hospital, Fourth Military Medical university, Xi＇an 710032, Shaanxi province, China

Subject headingsdrug screening assays, antitumor; tumor cells, cultured; stomach neoplasms/pathology; proto-oncogene proteins; apoptosis; Fas gene; bcl-2 gene

Abstract

AIMTo compare the expression level of fas gene and bcl-2 gene in gastric cancer cells sGC7901 and in gastric cancer MDR cells SGC7901/ VCR, to transduce fas cDNA and bcl-2 antisense nucleic acid into SGC7901/ VCR cells respectively, and to observe the expression of two genes in transfectants and non-transfectants as well as their drug sensitivity.

METHODSThe eukaryotic expression vector pBK-fas and pDOR-anti bcl-2 was constructed, and then transfected into SGC7901/ VCR cells by lipofectamine, respectively. The expression of mRNA and protein in SGC7901/ VCR cells and SGC7901 cells and transfectants was detected using Northern blot and Western blot and the drug sensitivity of transfectants for VCR, CDDP and 5-FU was analysed with MTT assay.

RESULTSAfter gene transfection, 80 for fas or 120 for antisense bcl-2 drug-resistant clones were selected from 2×10⁵ cells, the transfection efficiency was 0.04% and 0.06%, respectively. Two clones, SGC7901 fas/ VCR cells and SGC7901 anti-bcl-2/ VCR cells, were randomly selected for further incubation. Hybridization results showed that the expression level of fas mRNA and protein in SGC7901/ VCR cells was much lower, but the expression level of bcl-2 mRNA and protein was higher than that in sGC7901 cells, the expression level of fas mRNA and protein in SGC7901 fas/ VCR cells was higher, and the expression level of bcl-2 mRNA and protein was lower in SGC7901 anti bcl-2/ VCR cells than that in non-transfectants. MTT assay showed that transfectants were more sensitive to VCR, CDDP and 5-FU than non-transfectants.

CONCLUSIONbcl-2 gene displayed high expression and fas gene displayed low expression in drug resistant gastric cancer cells. Expression of bcl-2 protein was effectively blocked in SGC7901 anti bcl-2/ VCR cells by gene transfection, in contrast, the expression of fas mRNA and protein in SGC7901 fas/ VCR cells increased. Fas gene and bcl-2 antisense nucleic acid transfection sensitized drug resistant gastric cancer cells to chemotherapeutic drugs.

中国图书资料分类号R979.1

摘要

目的比较fas基因和bcl-2基因在胃癌耐药细胞与非耐药细胞表达的差异，将fas基因和bcl-2反义核酸导入胃癌耐药细胞，并分析转导前后的细胞在mRNA与蛋白的表达水平，研究转导株与非转导株对化疗药物敏感性的区别.

方法采用分子克隆技术将fas基因和反义bcl-2片段分别插入真核表达载体pBK-CMV和pDOR-SV40的多克隆克隆位点之间，以脂质体介导法将两个重组表达载体分别转染受体细胞SGC7901/ vCR，G418筛选克隆细胞，Northern blot, Western blot检测耐药细胞与非耐药细胞以及转导细胞中fas基因和bcl-2基因mRNA及其蛋白的表达，MTT法药敏实验检测转导细胞与非转导细胞对VCR、顺铂、5-FU的敏感性.

结果真核表达载体pBK-fas cDNA和pDOR-bcl-2 cDNA转导胃癌耐药细胞后，分别从2×10⁵细胞中筛选出大约80和120个抗性克隆，转导率各为0.4‰和0.6‰，随机各挑选2个克隆继续筛选与扩增培养，均获得了稳定的抗性细胞，我们将此命名为SGC7901 fas/ VCR cell和SGC7901 anti bcl-2/ vCR cell. 杂交结果表明，胃癌耐药细胞SGC7901/ vCR与非耐药细胞相比，bcl-2基因的表达明显较高，而fas基因表达极其微弱.转导株SGC7901 fas/ VCR cell的fas mRNA及其蛋白水平的表达显著高于非转导株，SGC7901 anti bcl-2/ VCR cell中bcl-2蛋白的表达明显低于非转导株.2株转导细胞对VCR、顺铂、5-FU的敏感性明显高于非转导株.

结论胃癌耐药细胞与非耐药细胞相比，bcl-2基因处于高表达状态，而fas基因处于极其低弱的表达状态.通过脂质体介导的基因转染，有效地阻断了bcl-2蛋白在SGC7901 anti bcl-2/ VCR cell的表达，明显增强了fas mRNA及其蛋白在SGC7901 fas/ VCR cell的表达. bcl-2反义核酸和fas基因转导胃癌耐药细胞后，对化疗药物的敏感性明显增加.

0引言

化疗是治疗肿瘤的主要方法之一，但目前所选用的化疗药物和用药方案，难以达到满意的疗效，其重要的原因之一就是肿瘤细胞对抗癌药物产生了耐药现象.要想提高化疗效果，就必须解决多药耐药的问题.近年研究表明，肿瘤细胞凋亡信息的抑制、细胞寿命的延长是产生多药耐药的机制之一^［1］.因此，有人提出通过诱导或促进细胞凋亡来逆转肿瘤细胞的耐药现象.我们将促进凋亡的fas基因和bcl-2反义RNA导入胃癌耐药细胞SGC7901/ vCR，并观察了目的基因在转导株的表达及分析了转导株对化疗药物的敏感性，可望为逆转胃癌细胞多药耐药现象的研究奠定基础.

1材料和方法

1.1材料胃癌耐药细胞SGC7901/ vCR及JM109菌株为本所保存的细胞与菌种，逆转录病毒载体pDOR-SV40和质粒表达载体pBK-CMV由第四军医大学基础部生化教研室崔大祥博士惠赠，pBluescript bcl-2 cDNA为本所保存质粒，pBluescript fas cDNA为日本Itoh教授惠赠. ecoRⅠ, BamHⅠ，SalⅠ，XhoⅠ，CIP， rNase A， T4 dNA连接酶，PMSF，Aprotinin，聚丙烯酰胺，ABC试剂盒，探针标记试剂盒及异硫氰酸胍等试剂均购于华美生物工程公司和Promega公司. lipofectamine来源于Gibco BRL. mTT，蛋白酶k，DEPC,MOPS,G418，胎牛血清及硝酸纤维膜为Sigma产品.［α-³²P］dATP购于北京亚辉公司，引物和寡核苷酸探针合成于上海Sangon生物制品公司.鼠抗人bcl-2抗体和兔抗人fas抗体均购于北京东方公司.

1.2方法

1.2.1重组载体的构建与鉴定根据资料，1.9kb的bcl-2 cDNA在pBluesecript KS的EcoRⅠ位点之间，2.5kb的fas cDNA在pBluesecript KS质粒的XhoⅠ位点之间.根据重组真核表达载体和反义核酸构建的方法，在酶切电泳证实原始质粒含有完整的fas cDNA和bcl-2 cDNA基础上，利用载体和基因序列中的位点，选择EcoRⅠ和BamHⅠ消化pBluesecript-bcl-2 cDNA，SalⅠ和EcoRⅠ消化pBluesecript-fas cDNA，冻融法回收0.622 kb的bcl-2 cDNA片段和1.83 kb的fas cDNA，在T4 DNA ligase作用下，分别与经相应的限制性内切酶消化的pDOR载体及pBK-CMV载体DNA连接(16℃,20 h)，转化JM109菌株制备的感受态细胞，常规培养.随机挑选Amp抗性菌落及小量制备重组质粒，通过酶切及琼脂糖凝胶电泳，鉴定其连接效果与正确性.根据fas cDNA序列分段设计3对引物，分别对pBK-fas cDNA重组子进行常规PCR扩增，并将PCR产物克隆至测序载体，随机引物法全自动测序，分析重组载体中目的基因的读框.

1.2.2基因转导与克隆筛选按照lipofectamine介导法，取0.5 g/ L纯化的pDOR-bcl-2和pBK-fas cDNA各1μL，用无血清的RPMI1640稀释成100μL，并与lipofectamine5 μL混合，室温静置10min，转染六孔板中处于对数生长期的SGC7901/ vCR细胞(2×10⁵ cells/孔). 24 h后，G418(500 mg/ L)筛选转染细胞. 同时，设立pDOR和pBK空载体转导细胞以及非转导细胞作为对照.克隆细胞形成后，逐个计数，随机挑选克隆，大量扩增抗性细胞.

1.2.3Southern blot和Northern blot收集生长状态良好的1×10⁷细胞，按细胞裂解法和一步法分别提取基因组DNA和总RNA.基因组DNA经EcoRⅠ消化后，普通琼脂糖电泳.细胞总RNA经热变性后，甲醛变性凝胶电泳.真空抽吸法转移DNA和RNA至硝酸纤维膜上.以随机引物的方法制备同位素［α-³²P］dATP标记的探针并进行预杂交、杂交及自动显影.

1.2.4Western blot以三去污剂裂解细胞的方法制备细胞膜蛋白，取1/2进行SDS-PAGE分离蛋白条带，考马斯亮蓝显色及脱色，仔细分辨条带的差异.另一半膜蛋白加样电泳后，100 v电转移过夜，SDS变性NC膜，常规ABC法结合抗体与显色.

1.2.5药物敏感性实验将转导细胞和非转导细胞按10³～10⁴ cells接种于96孔板，在200μL含100 mL/ L小牛血清的RPMI1640培养液中，分别加入顺铂、5-FU，VCR已知临床血浆高峰浓度的0.1倍(1μg,7μg,0.1μg)、1.0倍(10μg,70μg,1μg)及10倍(100μg,700μg,10μg)的剂量，培养3 d，加入MTT溶液(5 g/ L) 20 μL继续孵育4 h，弃上清，加入150μL DMSO，振荡10min以溶解结晶，酶联免疫检测仪上选择590nm波长测定各孔A(OD值).

2结果

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