HUANG Xiao-Feng¹, WANG Chun-Mei², DAI Xiao-Wen¹, PAN Bo-Rong³, YU Li-Bin¹, FANG Li¹, QIAN Bin¹ and ZHAO Yi-Ling⁴

¹Department of Pathology, Chinese PLA 117 Hospital, Hangzhou 310013, Zhejiang Province, China

²Department of Electronmicroscopy ³Room 12, Building 621, Fourth Military Medical University ⁴Department of Pathology, Fourth Military Medical University, Xi＇an 710033, Shaanxi Province, China

Subject headingscarcinoma, hepatocellular/pathology; cathepsin D/metabolism; chromogranins/metabolism; microscopy, confocal

Abstract

AIMTo investigate the expression and clinical significance of cathepsin D and chromogranin A in human primary hepatocellular carcinoma (HCC).

METHODS Double immunofluorescence staining techniques combined with laser confocal scanning microscopy were used to study cathepsin D and chromogranin A expression in 85 HCC patients.

RESULTS Cathepsin D was expressed in normal hepatocytes, while in HCC the staining showed regional variation and the fraction of strongly stained cells increased as the tumors became less differentiated and usually clinically more malignant. Cells which showed strong positivity for cathepsin D were present in 71/85(83.5%) cases. Strong expression of cathepsin D in cancer cells was related to histopathological features. They were more common in grade 3-4 (26/28， 92.9%) and grade 2 (46/53, 86.8%) tumors than in grade l tumors (1/4, 25.0%) (P＜0.01). There was no significant correlation between the age and cathepsin D expression. In cases with positive cathepsin D reaction the mean age was 52.1 ± 2.8 years (range 32 -68 years) and in the group with negative reaction, the mean age was 51.2 years ±4.5 years (range 28 years-71 years). No obvious relationship was observed between expression of CgA in cancer cells and the histopathological features. The CgA positive rate was 75.0%(3/4) in grade 1, 71.7%(38/53) in grade 2 tumors, and 71.4%(20/28) in grade 3-4 (P＞0.05). The coexpression of CgA and cathepsin D was found by double labeled immunofluorescence staining techniques. The results suggested that the processing of cathepsin D was disturbed in HCC cells and accumulated in the cells. Cathepsin D had proteolytic activity and autocrine mitogenic effect, both of which suggest some function in invasion. These findings demonstrated the expression of cathepsin D in HCC has some prognostic value.

CONCLUSION Chromogranin A and cathepsin D are expressed in a high proportion of HCC and the existence of cathepsin D in HCC might be related to processing of CgA. This is clearly a subject worthing further studies because of its potential in clinical applications.

中国图书资料分类号R735.7

摘要

目的探讨组织蛋白酶D和嗜铬颗粒素A在人原发性肝细胞癌(HCC)的表达及其意义.

方法免疫荧光双标记染色技术结合激光扫描共聚焦显微镜观察HCC 85例.

结果组织蛋白酶D在正常肝细胞有弱表达，但在HCC组织，组织蛋白酶D的表达显著增强，而且癌细胞荧光染色强度存在区域性差别，通常临床恶性程度越高、肿瘤分化越差，荧光染色较强的癌细胞越多. HCC的组织学分级越高，组织蛋白酶D的表达越多. 85例HCC中有71例癌细胞呈组织蛋白酶D强阳性，阳性率83.5%. 在组织学分级为3～4级的28例中，组织蛋白酶D阳性的占26例(阳性率92.9%)；组织学分级为2级的53例中，有46例阳性(阳性率86.8%)；而组织学分级为1级的4例中，仅有1例阳性(阳性率25.0%). 组织蛋白酶D阳性细胞的分布，在组织学分级不同的HCC中有明显差别(P＜0.01). 我们还发现组织蛋白酶D的表达与患者年龄无明显关系. 有组织蛋白酶D表达的患者平均年龄为51.2岁±2.8岁(32岁～68岁)，无组织蛋白酶D表达的患者平均年龄为51.2岁±4.5岁(28岁～71岁)(P＞0.05). 组织学分级为1级的HCC CgA阳性率为75.0%(3/4)，2级的阳性率71.7%(38/53)，3～4级的阳性率为71.4%(20/28). 经统计学分析表明，CgA阳性细胞的分布，在组织学分级不同的HCC没有明显差别(P＞0.05). 免疫荧光双标记显示，在大部分癌组织中，二者同时表达. 结果提示HCC的癌细胞对组织蛋白酶D的加工出现障碍，因此组织蛋白酶D在细胞中积聚. 由于组织蛋白酶D的蛋白水解酶活性和自分泌性丝裂原活性，因此组织蛋白酶D的表达增加可能在肿瘤的浸润和转移中有一定作用. 这些发现表明组织蛋白酶D对HCC有预后诊断价值.

结论组织蛋白酶D和CgA在绝大部分HCC都可同时表达. 也提示肝癌细胞中组织蛋白酶D可能与CgA的加工有关. 因为其潜在的临床应用价值，组织蛋白酶D在HCC表达显然是值得进一步研究的课题.

0引言

组织蛋白酶D最初是从乳腺癌细胞系检测到的一种溶酶体蛋白酶. 广泛分布于机体的正常组织中，包括肝细胞^［1］. 研究表明，组织蛋白酶D可通过蛋白水解作用或使其他蛋白酶前体活化，使细胞外基质和基底膜降解，参与肿瘤的浸润和转移^［2］. 组织蛋白酶D还可作为丝裂原(mitogen)，通过活化生长因子或与生长因子受体相互作用，促进肿瘤细胞的增殖^［3］. 已经证明蛋白酶抑制剂对癌细胞的浸润有抑制作用. 组织蛋白酶D的表达可能是预后判定的一种重要指标. 但组织蛋白酶D在原发性肝细胞癌(HCC)组织的表达、组织蛋白酶D的表达和HCC恶性程度之间的关系目前还不清楚. 嗜铬颗粒素A(chromogranin A, CgA)为存在于神经内分泌细胞Mr 50 000的一种酸性糖蛋白，Hsueh et al^［4］用免疫组织化学方法发现肝原发性神经内分泌癌的癌细胞可表达CgA，Warfel et al^［5］也发现肝母细胞瘤(hepatoblastoma)的瘤细胞有CgA，细胞角蛋白，生长抑素等同时表达. 近年有报道在HCC和肝内胆管细胞性肝癌的癌细胞也有CgA表达^［6，7］. CgA是嗜铬颗粒素/分泌颗粒素(chromogranin/secretogranin， Cg/Sg)家族的成员之一，参与神经内分泌细胞和神经内分泌肿瘤激素分泌的转录后加工. CgA可加工成一些具有生物学活性的小肽，如胰抑素(pancreastatin)等. 已经证明HCC的癌细胞可表达CgA^［6］，但在HCC中CgA与组织蛋白酶D的关系尚未见报道. 我们用免疫荧光双标组织化学结合激光共聚焦显微镜(confocal laser scanning microscopy， CLSM)对HCC组织中蛋白酶D和CgA蛋白的表达以及组织蛋白酶D的表达和HCC组织学分级之间的关系进行了观察，为进一步研究组织蛋白酶D和CgA在HCC组织中表达的意义提供形态学依据.

1对象和方法

1.1对象HCC 85例为本院和第四军医大学西京医院以及浙江省第一人民医院1986/1997收治的患者. 其中，男57例，女28例；平均年龄51.4岁±1.5岁(25岁～77岁). 因为有些病例没有足够标本用于免疫组织化学染色，而没有包括在内. 全部组织均取自手术切除标本，术前未经任何治疗并经病理证实为HCC. 组织经常规福尔马林固定、石蜡包埋，切片5或10μm，进行HE染色. 按Edmondson方法进行组织学分级^［8］.

1.2方法

1.2.1免疫荧光双标组化染色和激光共聚焦显微镜观察免疫荧光双标染色步骤如下^［7］：①5或10μm切片经脱蜡入0.01mol/L，pH 7.4的PBS水化，用30mL/L正常血清封闭30min，②吸去血清，将兔抗人组织蛋白酶D抗体(丹麦Dako公司，稀释度1∶300)和小鼠抗CgA的单克隆抗体(Sigma公司，稀释度1∶2000)混合在一起加到切片上，4℃孵育过夜；③用生物素化的羊抗兔IgG(武汉博士德生物工程公司，稀释度1∶50)和FITC标记的羊抗鼠IgG(武汉博士德生物工程公司，稀释度1∶200)，37℃孵育30min，PBS洗涤后，再加入streptavidin标记的Texas red(Sigma公司，效价1∶1000)，孵育30min. 从第二步开始，每一步骤均用0.01mol/L,pH 7.4的PBS洗 涤10min×3次. 最后用无荧光缓冲甘油封片，在CLSM下观察并拍照. 所有抗体均用含10mL/L牛血清清蛋白(BSA)的PBS稀释. 所用CLSM型号为Bio-Rad MRC-1024，装有Zeis 100显微镜. 用于FITC的激发波长为488nm，568nm用于激发TR. 用于图象采集的显微镜物镜为plan-Neofluar 40×油浸镜，数值孔径(NA)为1.3，图象存为512×512相素类型. ZOOM设为1.0. 若需要更大的放大倍数时，可以选择更大的ZOOM范围. 扫描所用的激发值依据样本的不同可以在共聚焦系统提供的梯级值中选择.

1.2.2组织蛋白酶D和CgA蛋白表达的记录整张切片上癌细胞胞质的阳性反应强度被分为3级：细胞对组织蛋白酶D或CgA无荧光记为阴性，有较弱的颗粒状荧光反应为弱阳性，有明确的