expression of chromogranin C/secretogranin Ⅱ and pancreastatin in pancreatic ductal carcinoma

wANG Chun-Mei¹, HUANG Xiao-Feng², pAN Bo-Rong³, DAI Xiao-Wen², MA Fu-Cheng⁴ and zHAO Yi-Ling⁴¹Department of Electron Microscopy, ²Department of pathology, 117 Hospital of PLA, Hangzhou 310013, Zhejiang Province, China ³Room12, Building 621, Fourth Military Medical University ³Department of pathology, Fourth Military Medical University, Xi＇an710032, Shaanxi Province, China

subject headingspancreatic neoplasms/pathology; carcinoma, infiltrating duct/pathology; chromogranins/metabolism; proteins/metabolism; pancreatic hormones/metabolism

Abstract

AIMTo determine the expression of chromogranin C/secretogranin Ⅱ(CgC/?SgⅡ) and pancreastatin (PS) in the pancreatic ductal carcinoma.

METHODS Immunohistochemical method combined with laser scanning confocal microscopy was used.

RESULTS Monoclonal antibody against CgC/?SgⅡ stained most, and possibly all, of the tumor cells in tumor tissue. The intense fluorescence was present in cytoplasm and negative in the nucleus. The immunoreactive CgC/?SgⅡwas homogeneous and granular in the cytoplasm. The large granular substances were observed in some tumor cells. Immunostainning with polyclonal antibody anti-PS antibody simultaneously was detectable in almost all of the CgC/?SgⅡ-positive neoplastic tissue sections of the well differentiated pancreatic ductal adenocarcinoma, but only small amount of CgC/?SgⅡ-positive cancer cells were PS-positive in the moderately differentiated pancreatic ductal adenocarcinoma. The immunoreactive PS was homogeneous in the tumor cells of well differentiated pancreatic ductal adenocarcinoma and granular or homogenous in the tumor cells of the moderately differentiated pancreatic ductal adenocarcinoma. The granular fluorescent substances of some tumor cells was immunostained for CgC/?SgⅡ only.

CONCLUSION CgC/?SgⅡ and PS can express in the tumor cells of the pancreatic ductal adenocarcinoma.

中国图书资料分类号R735.9

摘要目的确定嗜铬颗粒素C/?分泌颗粒素Ⅱ(CgC/?SgⅡ)和胰抑素(PS)在胰腺导管癌细胞中的表达.

方法采用荧光双标记免疫组织化学技术结合激光扫描共聚焦显微镜观察胰腺导管癌(1996/?1997，n=10)细胞中CgC/?SgⅡ和PS的表达.

结果在CgC/?SgⅡ单克隆抗体染色后发现，胰腺导管癌的大多数癌细胞呈CgC/?SgⅡ免疫反应阳性，免疫反应阳性物质位于细胞胞质内，而细胞核为阴性. cgC/?SgⅡ免疫阳性物质在胞质内为均质性或颗粒状，在一些腺管的癌细胞内存在较大的颗粒状荧光物质.同时用PS抗体的染色发现，在高分化胰腺导管癌CgC/?SgⅡ免疫阳性的细胞大部分同时表达PS，但在中分化胰腺导管癌CgC/?SgⅡ免疫阳性的细胞仅有一部分细胞表达PS.而且PS阳性物质在高分化胰腺导管癌细胞多为均质性，而在中分化胰腺导管癌细胞为均质性和颗粒状荧光，一些细胞的颗粒状荧光物质仅呈CgC/?SgⅡ免疫阳性.

结论胰腺导管癌细胞中存在嗜铬颗粒素C和胰抑素.

0引言

嗜铬颗粒素和(或)分泌颗粒素(chromogranins/secretogranins, Cgs)是一簇水溶性酸性糖蛋白，至少由3种成分构成，分别称为嗜铬颗粒素A(CgA)，嗜铬颗粒素B/?分泌颗粒素Ⅰ(CgB)和嗜铬颗粒素C/?分泌颗粒素Ⅱ(CgC/?SgⅡ)^［1］. cgs存在于几乎所有内分泌、神经内分泌和神经组织^［1-4］.已经通过免疫组织化学、放免测定、原位杂交和Northern blot技术确定了不同嗜铬颗粒素在许多组织的定位^{［1，3，4］}.在亚细胞水平，嗜铬颗粒素储存在含有蛋白和肽类激素的大致密核心囊泡中(large dense core vesicles)^［1］. 其基因编码带有N末端信号肽的单氨基酸链，该信号肽可引导蛋白进入转运高尔基复合体(trans-Golgi)调节途径，重要的化学特性是谷氨酸含量高，具有钙结合能力^［1］.另一个重要特征是嗜铬颗粒素具有几个双碱性氨基酸(dibasic amino acid)位点，是形成生物活性肽的裂解部位^［5］.来源于CgA的具有确定生物学功能的生物活性肽有胰抑素(pancreastatin=CgA249-301),β颗粒素(β-granin=CgA1-114)，chromostatin=CgA124-143和vastatin=CgA1-76.已经发现CgC和胰抑素可存在于正常胰岛和胰岛细胞瘤^［6］.但在胰腺导管腺癌的表达尚未见报道，我们采用免疫组织化学结合激光共聚焦显微镜对胰腺导管腺癌细胞PS和CgC/?SgⅡ的表达进行了观察，为进一步研究CgC/?SgⅡ在胰腺肿瘤中存在的意义提供形态学依据.

1材料和方法

1.1材料胰腺导管癌10例为第四军医大学西京医院1996/?1997收治的患者.全部组织均取自手术切除标本，组织经常规福尔马林固定，石蜡包埋，切片厚5或10?μm，进行HE染色，并经病理证实为高分化和中分化胰腺导管腺癌.

1.2方法免疫组化染色和激光共聚焦显微镜观察免疫荧光双标染色步骤如下：切片经0.01?mol/?L，pH 7.4的PBS水化后，用30?mL/?L正常羊血清封闭30min，吸去血清，将兔抗PS的抗体(Sigma公司，稀释度1∶2000)和小鼠抗CgC/?SgⅡ mAb混合在一起加到切片上，4℃孵育过夜；经0.01?mol/?L，pH 7.4的PBS洗涤10min×3次，加入生物素化的羊抗兔IgG(武汉博士德生物工程公司，稀释度1∶200)，37℃孵育30min，PBS洗涤后，加入FITC标记的羊抗小鼠IgG(武汉博士德生物工程公司，稀释度1∶50)和streptavidin标记的Texas red (Sigma公司，效价1∶1000)，37℃孵育30min,经0.01?mol/?L，pH 7.4的PBS洗涤10min×3次，用无荧光缓冲甘油封片后，直接在LSCM下观察并拍照.所用LSCM型号为Bio-Rad MRC-1024,FITC的激发波长为488?nm.用于图象采集的显微镜物镜为Plan-Neofluar 40×油浸镜，数值孔径(NA)为1.3.图象存为512×512相素类型. 根据需要选择ZOOM范围.扫描所用的激发值依据样本的不同可以在共聚焦系统提供的梯级值中选择.

对照用无关抗体以及正常兔和羊血清取代一抗染色作为抗体特异性对照，用PBS替代一抗作阴性对照，省略一抗作空白对照.

2结果

在CgC/?SgⅡ mAb染色后发现，胰腺导管癌的大多数癌细胞呈PS免疫反应阳性(图1-9，绿色)，免疫反应阳性物质位于细胞胞质内，细胞核为阴性. cgC/?SgⅡ免疫阳性物质在胞质内为均质性或颗粒状(图1-9)，在一些腺管的癌细胞内存在较大的颗粒状荧光物质(图4，7，红色).同时用PS抗体的染色发现，在高分化胰腺导管癌CgC/?SgⅡ免疫阳性的细胞大部分同时表达PS(图3，黄色)，但在中分化胰腺导管癌CgC/?SgⅡ免疫阳性的细胞仅有一部分细胞表达PS(图6，9，黄色).而且PS阳性物质在高分化胰腺导管癌细胞多为均质性(图2)，而在中分化胰腺导管癌细胞为均质性和颗粒状荧光(图5，8)，一些细胞的颗粒状荧光物质仅呈CgC/?SgⅡ免疫阳性(图6，9).

3讨论

CgC(SgⅡ)是Rosa et al^［7］ 1981年在牛垂体前叶发现的一种Mr70000的分泌蛋白，随后Lee et al^［8］在肾上腺髓质细胞系PC12细胞发现的Mr86 000～84 000的蛋白质被证明与垂体前叶的蛋白质属于同一类型，并对SgⅡ在分泌肽类激素细胞的分布进行了观察^［7］.发现SgⅡ不仅可广泛分布于垂体前叶的各种内分泌细胞^［9］，也可分布于神经细胞和其他器官的内分泌细胞^［7，9］.免疫电镜的观察发现SgⅡ存在于内分泌颗粒的基质中^［9，10］.通过免疫荧光双标记结合激光共聚焦显微镜，我们观察了CgC/?SgⅡ和PS在胰腺导管腺癌细胞的表达，结果表明在CgC/?SgⅡ免疫反应阳性的细胞中，有部分细胞同时也呈现PS免疫反应阳性.实验中发现有些CgC/?SgⅡ免疫阳性物质呈细小或粗大的颗粒状，很可能是由CgC/?SgⅡ形成的分泌颗粒，有研究发现CgC/?SgⅡ存在于神经内分泌细胞的分泌颗粒中^［11］.但我们发现的CgC/?SgⅡ免疫反应阳性物质的确切性质和亚细胞定位应进一步通过电子显微镜观察加以明确.一般认为，嗜铬颗粒素可作为神经内分泌肿瘤的一种标志物，但一些研究发现嗜铬颗粒素不仅可在神经内分泌细胞表达，也可在非神经内分泌细胞表达^{［12，13］}.结合本实验结果，说明嗜铬颗粒素并不是一种很理想的神经内分泌标志物.即单凭这一指标说明肿瘤具有神经内分泌分化倾向尚不充分，应结合其他指标或通过电子显微镜加以证实.

PS最初是从猪胰腺分离、纯化和鉴定的一种49个氨基酸的肽，其激素前体是存在于神经内分泌细胞(包括胰岛)的一种糖蛋白CgA. cgA在细胞内外都可加工成PS，这一加工过程是组织特异性的，