ZHENG Shi-Xi¹, CHEN Han-Qin³, WANG Xian-Song², YANG Jun³, RUAN You-Bing² and WU Zhong-Bi²

¹Department I of Pharmacology, Shanghai Institute of Meteria Medica, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200031, China

²Department of Ultrastructural Pathology, Research Center of Experimental Medicine, Tongji Medical University, Wuhan 430030, Hubei Province, China

³The Affiliated Hospital of Wuhan Postgraduate Medical College, Wuhan 430030, Hubei Province, China

Subject headingsliver neoplasms/pathology; estradiol/blood; endothelial/growth factors/analysis; receptors, laminin/analysis

Abstract

AIM To understand the relationship between elevated serum estradiol (E₂) and the metastasis of hepatocellular carcinoma (HCC).

METHODS Radioimmunoassay (RIA) was used to measure serum E₂ level in patients with HCC. In situ hybridization was used to investigate vascular endothelial growth factor (VEGF) and laminin receptor (LN-R) RNA expression in hepatoma cell line CBRH 7919 stimulated by extragenous estradiol.

RESULTS Elevated serum E₂ concentration was found in both patients with and without metastasis. It was significantly higher in the former than that in the latter. The results of in situ hybridization showed that extragenous E₂ could stimulate both VEGF and LN-R mRNA expression.

CONCLUSION Elevated serum E₂ is associated with the metastasis of HCC, which may be upregulate the expression of VEGF and LN-R mRNA in the tumor cells.

中国图书资料分类号R735.7

摘要

目的了解血清雌激素升高与原发性肝细胞癌(HCC)转移的关系.

方法应用放射免疫分析法(RIA)对HCC患者血清雌二醇(E₂)含量进行了检测，并应用原位杂交研究外源性E₂对肝癌细胞系CBRH 7919血管内皮生长因子(VEGF)和层粘蛋白受体(LN-R)表达的影响.

结果HCC患者血清E₂水平较正常者显著升高，且HCC有转移者血清E₂水平较无转移者亦显著升高；原位杂交结果显示，外源性E₂能够增加CBRH 7919细胞表达VEGF和LN-R mRNA.

结论血清E₂水平增高与HCC转移密切相关，它有可能通过促进VEGF和LN-R的合成而影响肿瘤的转移过程.

0引言

1973年Baum et al^［1］报道肝脏肿瘤的发生与性激素水平的改变有关. 国人的研究发现肝细胞癌(HCC)患者血清雌二醇(E₂)水平明显升高^［2］，认为血清E₂升高与HCC发生、发展密切相关. 近年人们注意到雌激素还能促进某些肿瘤细胞中血管内皮生长因子(VEGF)和层粘蛋白受体(LN-R)的表达，对肿瘤细胞的生物学行为起重要的调控作用，并影响肿瘤的转移和预后^［3,4］. 为了解雌激素在HCC转移中的作用，我们应用放射免疫分析法(RIA)对HCC患者血清E₂水平进行检测，同时研究其对肝癌细胞系CBRH 7919 VEGF和LN-R表达的影响，进而了解E₂与HCC转移的关系.

1材料和方法

1.1材料男性HCC患者24例，年龄35岁～60岁，其中12例患者经影像学检查发现肝外脏器转移和(或)经病理检查发现门静脉癌栓或肝门淋巴结内有癌细胞；另外12例无转移. 另外将14例健康体检者作正常对照. 所有血清标本均清晨静脉采血，分离出血清后置-20℃保存待测. 大鼠肝癌细胞系CBRH 7919来源于中科院上海细胞生物研究所.

1.2方法

1.2.1血清E₂测定采用体外RIA对血清标本中E₂进行检测. 试剂盒由德谱公司(DPC)提供，操作步骤按说明书进行. 为减少误差，所有标本均在同批实验中双管检测. 标准曲线按logit-log回归，并计算每例标本E₂的含量. 统计结果以均数±标准差(±s)表示，采用两样本均数t检验进行显著性分析.

1.2.2E₂对CBRH 7919细胞的刺激作用在有盖玻片的24孔培养板中，每孔加入10³对数生长期细胞，置37℃ CO₂培养箱中培养12h，实验组每孔加入5.5×10^-9mol/L (15μg/L)雌二醇(Estradiol-17β，DPC)，对照组每孔加入等体积灭菌双蒸水，置37℃ CO₂培养箱12h. 培养液为含200mL/L胎牛血清的RPMI-1640(Gibco BRL)培养基.

1.2.3原位杂交细胞爬片经冷丙酮室温固定20min，0.2mol/L HCl作用20min，2g/L甘氨酸PBS(pH 7.4)作用5min，滴加蛋白酶K混合液(含蛋白酶K 200μg/mL，0.5mol/L Tris-HCl pH 7.6，1mol/L CaCl₂)置37℃ 20min，每片滴加预杂交液(含6×SSC，450g/L去离子甲酰胺，5×Denhart液，100mg/L变性鲑精DNA)置37℃ 1h，分别滴加含变性探针的杂交液(VEGF cDNA探针由北京医科大学心血管基础研究所汤健教授惠赠，LN-R cDNA探针由北京医科大学分子病理室提供. 上述探针采用Boehringer Mannheim公司地高辛标记试剂盒)置42℃ 48h，常规显色、封片. 在200×视野下，随机选择30个细胞，用TJTY-300型图象分析仪测定其光密度，求得其平均值，并采用t检验进行显著性分析.

2结果

2.1血清E₂变化正常对照组14例为42.4ng/L±19.4ng/L，HCC未转移组12例为67.6ng/L±20.4ng/L，HCC转移组12例为108.4ng/L±45.4ng/L. HCC未转移组和HCC转移组血清E₂水平均显著高于正常对照组(t值分别为3.10和4.75，P＜0.01和P＜0.01). HCC转移组血清E₂水平显著高于HCC未转移组(t=2.72，P＜0.05).

2.2原位杂交阳性结果为紫蓝色颗粒，分布于胞浆和胞核. 图象分析结果：VEGF对照组平均光密度为0.18±0.10，实验组为0.25±0.11，P＜0.05；LN-R对照组平均光密度为0.20±0.07，实验组为0.24±0.08，P＜0.05.

3讨论

肝脏不仅是雌激素的代谢器官，同时也是雌激素作用的靶器官之一^［5］. 雌激素除可直接刺激肝脏细胞过度增生乃至产生癌变外^［1］，尚可促进二乙基亚硝胺诱发的大鼠肝癌形成^［6］. 另外，HCC患者的肝功能常常会受到不同程度的损伤，引起肝脏对雌激素的灭活作用减弱，继而导致雌激素在体内蓄积. 我们对HCC患者血清E₂水平进行了检测，HCC组显著高于正常对照组，与文献相符^［2］. 值得注意的是，HCC转移组血清E₂水平显著高于未转移组，提示E₂有可能影响HCC的转移过程.

以前的研究表明，雌激素是通过与细胞表面的雌激素受体结合而发挥作用的^［5］. 但是，Kohigashi et al^［7］分别用结合法和酶联分析法对肝硬变、原发性肝癌及其周围正常组织的受体量进行了检测，结果显示，癌组织中受体量低于肝硬变组织，后者又低于正常组织，说明雌激素受体与HCC无关. 由此可见，雌激素对细胞的恶性转化作用除可通过受体途径外，它还能通过非受体途径对肿瘤细胞的生物学特征起调控作用，进而影响肿瘤的转移过程. 肿瘤微血管生成以及肿瘤细胞与基质的相互作用在转移过程中起重要的作用. 最近的研究表明，这些作用也可受性激素如E₂的调节^［3，4］. 在肿瘤微血管生成过程中，血管内皮生长因子(VEGF)起重要的作用. Charnock-Jones et al^［3］的研究认为E₂能增加子宫内膜癌细胞系的VEGF mRNA稳定性，增加VEGF的合成，继而增加肿瘤细胞的转移潜能. 另外，在肿瘤细胞与基质的相互作用中，层粘连蛋白受体(LN-R)的过度表达有利于肿瘤的转移. Martignone et al^［4］对乳腺癌组织中LN-R进行的研究发现，绝经前患者的癌组织中LN-R蛋白的表达明显增强，且这部分患者常有淋巴结转移和远处转移，提示E₂水平升高与LN-R的过度表达相关. 有鉴于此，我们对同批HCC患者进行了研究，发现在有转移的癌组织中VEGF和LN-R的蛋白质和mRNA均有高表达^［8,9］，血清E₂升高与组织中VEGF和LN-R过量表达有很大的相关性. 体外进一步研究发现，E₂能促进CBRH 7919细胞VEGF和LN-R RNA的表达. 此结果提示，E₂也可通过促进VEGF和LN-R合成影响HCC的转移过程.

由于传统的内外科方法治疗HCC的局限性，应用抗雌激素的方法治疗HCC已成为目前综合治疗的手段之一. 最近国外有学者应用雌激素抑制剂治疗HCC获得成功的报道^［10］. 所以，深入研究雌激素与HCC的因果关系及其在HCC发生、发展和转移中的作用将进一步为人类控制HCC创造条件.