lI Jiang, WANG Wen-Liang, WANG wen-Yong, LIU Bin and WANG Bo-Yun

Department of Pathology, Cancer Research Institute, Fourth Military Medical University, Xi＇an 710033, Shaanxi Province, China

Subject headingsliver neoplasms/pathology; apoptosis; histocytological preparation technics

abstract

AIMTo examine the occurrence of apoptotic cell death in HCC-9204 cell line and 21 formalin fixed, paraffin-embedded biopsy specimens from liver cirrhosis (6 cases) and hepatocellular carcinoma (15 cases).

METHODS Apoptosis of HCC-9204 cell line was induced by adriamycin (20μmol/L). Modified TUNEL assay was conducted using in situ cell death detection kit fluorescein (Boehringer Mannheim). Sections were pretreated by microwave. Control experiments were also performed, including dNase-digestion before TUNEL as positive control and TdT and FITC-dUTP deletion as negative control. Routine HE staining was conducted on serial sections.

RESULTS Nearly all sections had positive signals by TUNEL staining, which were observed on the nuclear sites. HE staining approved that TUNEL positive hepatocytes often exhibited cell shrinkage, dramatic convolution and blebbing, and condensed nuclei. In noncancerous tissues, most of TUNEL-positive cells were scattered. In HCC tissues, tUNEL-positive cells were morphologically scattered or clustered. TUNEL LIs were 0.075， 0.395， and 0.105 in liver cirrhosis, cancerous and pericancerous tissues, respectively. The difference in TUNEL LIs was significant between liver cirrhosis and HCC (P＜0.01). With the progress of HCC, the TUNEL LIs increased.

CONCLUSION Modified TUNEL assay is at present a useful method to detect apoptotic cells in situ, especially for formalin fixed, paraffin-embedded sections.

中国图书资料分类号R735.7

摘要

目的采用TUNEL技术对福尔马林固定、石蜡包埋的肝组织和培养肝癌细胞进行染色，以探讨肝细胞凋亡的形态特征和分布.

方法使用德国宝灵曼公司生产的原位末端标记试剂盒. 石蜡包埋组织经微波处理后，行常规TUNEL染色，观察凋亡细胞的形态和分布.

结果TUNEL阳性信号为黄绿色或黄色荧光，位于胞核，呈小圆形或环行. TUNEL阳性细胞大多在形态学上表现为凋亡的细胞. 对肝组织TUNEL LI的分析显示，肝癌组织中细胞凋亡指数(0.395)比肝硬变(0.075)和癌旁肝组织(0.105)要高，且癌组织恶性程度越高，这种凋亡就越显著.

结论改进的TUNEL技术对福尔马林固定、石蜡包埋的难处理组织进行染色是一个有效的方法.

0引言

目前检测细胞凋亡的方法有形态学的和基因组DNA的分析. 由于凋亡小体只在凋亡过程的某个时相出现， 而且持续时间短，很快即被巨噬细胞或实质细胞吞噬，所以在光镜下，很难区分正在凋亡的细胞. 原位凋亡检测是近年发展起来的细胞凋亡检测技术，包括DNA聚合酶I，Klenow酶催化的原位末端标记技术和末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的d-UTP缺口末端标记技术(TUNEL)，后者目前被广泛采用. 它可在组织原位同时显示凋亡细胞的形态和分布. 这是其他检测方法所不及的^［1，2］. TUNEL技术尽管存在着众多优点，但也受到来自标本、组织来源、操作技术等的限制. 常常造成假阴性或假阳性. 我们主要采用德国宝灵曼公司生产的原位末端标记试剂盒对福尔马林固定、石蜡包埋的肝组织和培养肝癌细胞进行TUNEL染色以探讨肝细胞凋亡的形态特征和分布.

1材料和方法

1.1材料①实验细胞：HCC-9204细胞系是由本室建立的一株肝癌细胞系. ②石蜡组织：来自西京医院21例活检的肝组织，其中肝硬变6例，肝细胞肝癌15例(按WHO标准分3级，一级6例，二级4例，三级5例). 病理形态学基本正常，临床诊断与肝脏损害无关

图1TUNEL阳性的肝细胞有凋亡的形态学特征，如细胞皱缩、核浓缩(a，HE染色，×200)和“出泡”现象(b，HE染色 ×200).

2荧光显微镜显示在肝硬变(e,TUNEL×200)和肝癌组织中的TUNEL阳性信号呈小圆形或环行的核阳性. 在肝癌组织中可见散在分布(c,TUNEL×200)和成簇分布(d,TUNEL×200).

3荧光显微镜显示阿霉素诱导HCC-9204肝癌细胞系的凋亡(f,TUNEL×200)，可见典型的凋亡小体结构(如箭头所示).

图4统计分析肝硬变、肝细胞肝癌及其癌旁组织的TUNEL LI.

的尸检胎肝做正常对照. 常规100mL/L福尔马林固定，石蜡包埋，做厚5μm连续切片，挂APES胶.

1.2方法

1.2.1培养细胞凋亡的诱导用20μmol/L阿霉素(意大利爱宝大药房)诱导细胞凋亡，具体方法参见文献［3］.

1.2.2TUNEL染色采用德国宝灵曼公司生产的原位末端标记试剂盒(Cat.No.1684795). 在操作手册和已有文献^［4,5］的基础上进行方法改进，其步骤简述如下：①组织片常规脱蜡至水；②微波处理：0.01mol/L枸橼酸盐缓冲液，pH 6.0，至微波中加热92℃～98℃，持续 10min，微波功率为800W；③封闭内源性DNA酶：DEPC (diethyl-pyrocarbonate)水洗，室温放置30min；④加用荧光素(FITC)标记的核苷酸和脱氧核苷酸末端转移酶混合液，37℃，60min；⑤在荧光显微镜下观察；⑥阴性对照为省去TUNEL反应液：阳性对照用DNA酶I(美国Sigma公司产品)，分别以50mg/L，0.1g/L，0.5g/L和1.0g/L预处理组织. 对HCC-9204细胞系的TUNEL染色，则取细胞爬片，经40mL/L多聚甲醛固定后，置穿透液(含1g/L Triton X-100的1g/L枸橼酸钠)中，4℃，2min，其余步骤接④. 结果判定是以核阳性为判定标准，并结合HE染色，对HE染色证实为坏死的细胞不记数. 随机移动组织片，选择相邻的10个视野. 排除有严重的炎症反应和坏死灶的区域，因为这给单个凋亡细胞的鉴别带来困难. TUNEL标记指数(TUNEL LI)是记数每例组织片中至少3000个细胞核中出现的凋亡细胞数，并进行统计学分析.

1.2.3HE染色连续切片进行HE染色. 一般认为，典型的凋亡肝细胞HE染色表现为细胞体积变小、细胞表面显著的扭曲和出泡、细胞核浓缩以及染色体边集呈新月体状.

2结果

2.1光镜观查①肝组织病变有灶性和碎片样坏死，坏死多见于小叶周边区，而单个细胞的死亡分布于肝小叶内. 可见一些带有凋亡形态特征的肝细胞即：细胞核染色质浓缩、边集呈新月体样，胞质明显嗜酸性，有或没有胞质的浓缩，周围无炎细胞浸润(图1a). ②阿霉素诱导的HCC-9204细胞变圆，贴壁能力逐渐消失，细胞核深染，细胞浆浓缩，染色质呈团块状，细胞有“出泡”现象(图1b).

2.2荧光显微镜观察①TUNEL染色结果显示，TUNEL阳性信号为黄绿色或黄色荧光，位于胞核，呈小圆形或环形. 有些阳性细胞出现于肝窦中，大约10μm左右的小圆形颗粒，其形态难与淋巴细胞和Kupffer细胞区分. 在正常胎肝组织中，阳性细胞很少见. 在肝硬变组织中，阳性细胞在小叶内多为散在分布于小叶周边靠近汇管区居多(图2e). 而在癌组织中，既有散在分布的又有成簇分布的阳性细胞(图2c,2d). 在癌旁肝组织中阳性信号较前者少见，分布类似于肝硬变. DNA酶 I作用的阳性对照为阳性，去除TUNEL反应液的阴性对照为阴性. ②阿霉素诱导的HCC-9204细胞系TUNEL染色显示同上，另外可见许多典型的凋亡小体结构(图3f)所示. ③连续切片对照H.E.染色，TUNEL阳性细胞大多在形态学上表现为凋亡的细胞.

2.3TUNEL LI记数比较肝硬变和肝细胞肝癌组织及其癌旁肝组织的TUNEL LI记数. 结果显示，癌组织中TUNEL LI值(0.395)明显高于肝硬变(0.075)和癌旁肝组织(0.105)中的TUNEL LI值(P＜0.01)，并且恶性程度越高的癌组织中TUNEL LI值越高(P＜0.01). 而肝硬变与癌旁肝组织间的TUNEL LI无显著性差别. 随着肿瘤的恶性程度的增高，其癌旁组织的TUNEL LI也有所增高，但无显著性差别. 如图4所示.

3讨论

DNA聚合酶I,Klenow酶催化的原位末端标记技术和TdT酶介导的dUTP缺口末端标记技术是近年发展起来的细胞凋亡检测技术. 当双链DNA分子的一条链产生缺口时，DNA聚合酶I催化一种模板依赖的核苷酸聚合反应. 而从理论上讲，这种反应既可检测凋亡的DNA，又可检测由于细胞坏死时多种内源性核酸内切酶水解产生的随机片段. 因此在特异性上，受到了极大限制，目前已很少使用. 而TdT能够对双链DNA断裂的平端进行末端标记，这种反应不依赖模板. 从理论上讲，它比依赖模板的缺口翻译技术敏感且反应的<