Subject headingsretroviridae/genetics; genetic vectors; interleukin-6/genetics; gene expression; fibroblasts; transduction, genetic

Abstract

AIMTo study the transfer and expression of interleukin-6 gene in NIH3T3 cells for IL 6 gene therapy.

METHODSHuman IL6 gene was reconstructed in retrovirus vector and transferred into incasing cells PA317 by lipofectamine mediated method. The clones of the cells transferred with hIL 6 were selected by G418. Targeted NIH3T3 cells were infected with the virus granules secreted from PA317 and also selected by G418. the insertion and expression of hIL 6 gene in NIH3T3 cells were analysed with southern blot and Northern blot.

RESULTSHuman IL6 retrovirus vector (pZIPIL-6) was successfully reconstructed. Positive clones which strongly resisted G418, were selected and hIL 6 retrovirus granules with high biological activity were prepared. Southern blot and Northern blot results confirmed the stable transfer and high expression of hIL 6 in NIH3T3 cells.

CONCLUSIONHuman iL 6 can be successfully transferred and effectively expressed in targeted cells by retroviral vector and may be used in gene therapy.

中国图书资料分类号R394-33

摘要

目的将IL6基因转导至成纤维细胞NIH3T3，并使转染株有效地表达IL6，为IL 6转基因治疗奠定基础.

方法利用重组载体构建技术将质粒pUCIL6 cDNA的目的片段连接于逆转录病毒载体上，并以脂质体介导的方法将重组载体转染包装细胞PA317，以G418筛选克隆细胞，浓缩克隆细胞上清以制备重组病毒液，继之感染NIH3T3细胞后，进行Southern blot和Northern blot分析，检测目的基因在靶细胞的整合与转录水平.

结果成功地构建了重组载体pZIPIL6 cDNA，筛选出抗生较强的克隆细胞，制备了高滴度的重组病毒液.杂交结果表明转导株3T3IL 6具有IL6基因的整合和相应mRNA的高表达.

结论IL 6基因能稳定整合至靶细胞并进行有效的转录表达，为IL6基因治疗的应用奠定了可靠的基础.

0引言

IL 6是一种能调节免疫应答、急性期反应、造血过程，并在宿主防御机制中起重要调节作用的多功能细胞因子，机体内淋巴和非淋巴组织细胞均能成组性地表达IL6和(或)在几种不同刺激条件下反应性地分泌IL6，而且IL 6受体分布广泛，可通过自分泌或旁分泌作用调节组织细胞的各种生物学活动.在体外，IL 6能促进B细胞分化和分泌抗体，激活T细胞，诱导CTL，增强NK活性和LAK活性.在实验动物体内，IL 6具有显著抗肿瘤和抗感染作用.因此利用分子克隆技术进行IL6基因转导与表达的研究具有重要意义.

1材料和方法

1.1材料菌株：JM109为本所保存菌种；质粒：pUCIL-6 cDNA，pZIP-Neo-cDNA为本所姜泊博士从军科院引进；细胞：PA317，NIH3T3均为本所保存细胞；酶及试剂：EcoRI,BamHI, ecoRV, T₄连接酶，CIP，RNase a，探针标记试剂盒等均购于华美生物工程公司和Promega公司，lipofectamine源于Gibco bRL，蛋白酶K，DEPC，MOPS， g418，胎牛血清为Sigma产品，［α-³²P］dATP购于北京亚辉公司.

1.2 方法

1.2.1重组IL6基因逆转录病毒载体的构建及鉴定参照分子克隆^［1］方法(图1)：pUCIL-6 cDNA经BamHI和EcoR v双酶切后，IL 6 cDNA片段的EcoRV平端处与磷酸化的BamHI接头(8mer)连接，BamHI酶切及T4 dNA Ligase作用下与经BamHI酶切及去磷酸化的pZIP-Neo-SV(x)载体DNA连接(16℃，20 h)，转化JM109受体菌.随机挑选Amp抗性克隆及小量制备重组质粒，分别用BamHI，EcoRI酶切及电泳，鉴定其大小及方向.

1.2.2 转染与包装及重组病毒液的制备以lipofectamine介导法^［2］将纯化的pZIPIL-6cDNA转染PA317细胞，G418(500 mg/ l)筛选克隆，抗性细胞形成后，取上清离心浓缩(4℃40 000 g×1 h)，以1%原体积稀释沉淀，加入polybrene(8 mg/ l)以提高病毒滴度.取病毒液感染NIH3T3细胞，并以G418筛选克隆，然后计算其滴度(克隆数×病毒液稀释倍数).

1.2.3 Southern blot, Northern blot扩增NIH3T3克隆细胞(3T3 iL 6)，采用细胞裂解法及异硫氢酸胍法分别提取基因组DNA及总RNA，并分别进行普通琼脂糖电泳和甲醛变性电泳，利用真空转移装置从凝胶转移固定DNA，RNA至NC膜上，然后与³²P标记的探针进行杂交，以检测目的基因的整合与转录水平.

2结果

2.1重组载体的构建将转化的重组子扩增及制备质粒后BamHI酶切分离出1.12kb的IL6 cDNA及10.14载体DNA，说明构建成功，目的片段大小正确.重组载体共有3个EcoRⅠ位点，其中一个位于IL6 cDNA的5＇端，用EcoRⅠ消化重组载体，如果插入的IL6 cDNA为正向连接应产生5.73，3.09，2.44kb的3个片段，如果为反向连接则产生1.97，2.44，6.83kb的3个片段，图2结果表明所构建的重组载体为正向连接.

2.2 克隆细胞的形成及病毒滴度的测定基因转染并筛选5 wk后，培养孔内逐渐出现多个抗性细胞克隆.而转染细胞筛选7 d～10 d后全部死亡，且不见长出新的细胞.重组病毒液感染3T3细胞并筛选3 wk～4 wk后，出现了大量的克隆细胞(3T3 iL 6)，根据滴度计算方法得出其病毒滴度为5.1×10⁸cfu/ l.

图1重组IL6逆转录病毒载体的构建

图2EcoRⅠ消化pZIPIL-6 cDNA

a HindⅢ-cutλ-DNAB ecoRⅠ-cut pZIPIL-6 cDNA

图3α-³²p标记探针的Southern blot杂交显影

a 3T3 IL6 cellsB 3T3pZIP cellsC3T3 cells

图4α-³²p标记探针的Northern blot杂交显影

a 3T3 IL6 cellsB 3T3pZIP cellsC3T3 cells

2.3基因整合与转录的结果3T3 iL 6克隆细胞杂交结果发现在与IL6 cDNA片段大小一致的位置上具有明显的cDNA和mRNA杂交信号(图3，4)，而未经转导基因和转导空载体的3T3细胞均未出现任何杂交带，可见IL6基因转导成功，并有相应mRNA的高效表达.

3讨论

生物工程技术的不断进步已使许多重组的细胞因子应用于肿瘤及一些免疫、炎症疾病的临床治疗，但目前仍面临着成本高，效果不肯定，T_1/2及毒副作用大等制约因素，因此利用基因转移技术将细胞因子基因导入靶细胞，使其在局部持续分泌一定量的细胞因子，直接杀伤肿瘤细胞，或细胞因子网络刺激机体免疫系统，提高免疫应答，加强免疫细胞的抗炎抗肿瘤作用，是细胞因子基因疗法的主要研究方向.

将目的基因转移至合适的靶细胞内是基因治疗的前提，而外源性基因若无理想的载体协助，就难以进入受体细胞^［3］.逆转录病毒载体能稳定地整合进入宿主细胞染色体基因组，并高效率地表达，是目前较为常用的基因转移载体^［4］，但它必须通过包装细胞的辅助与互补作用后，才能使包装细胞分泌既含重组DNA，又有一次性感染整合作用而无完整性病毒复制能力的缺陷型病毒颗粒^［5］.这是因为逆转录病毒载体是Moloney小鼠白血病毒(MOLMV)改建而成，病毒的大部分内部顺序已被外源基因所取代，剩下的逆病毒DNA包括病毒基因组的两端即LTRs，缺失的顺序包括gag,env,pol三部分编码野生型感染性病毒颗粒所必须的病毒基因，故为缺陷型病毒，不能编码病毒结构蛋白^［6］.包装细胞为小鼠纤维细胞系NIH3T3用标准DNA转染技术将能表达病毒蛋白质的重组DNA导入后培养设计而成，能反式补偿进入包装细胞的载体DNA所失去的功能^［7］，当将含有目的基因的载体DNA转染包装细胞后，可为逆转录病毒提供结构蛋白组分，从而使重组载体DNA被转录成相应的RNA，后者被装配成子代逆病毒颗粒并被分泌入介质中，因而收集其细胞培养上清液，即为含目的基因的重组DNA病毒.由于载体上所含的标记基因为新霉素耐药基因(Neo)，当转染后该基因与IL6 cDNA互相连接并稳定地插入基因组，这个异原嵌合的Neo基因将受与对G418的抗性，故可用G418筛选转导成功的克隆细胞. nIH3T3细胞为PA317的母系细胞，而且不含病毒基因和我们所要克隆的目的基因，因而用重组病毒液感染3T3细胞后，通过相应的检测手段，能直接而真实地反映在包装细胞内被装配和释放的重组载体DNA假病毒颗粒的效果及滴度，而且作为基因转导的靶细胞，可以正确地反映目的基因在细胞内整合与转录水平.我们<