department of Pathology, Medical College of Shantou University, Shantou 515031, guangdong Province, China

Subject headingsliver neoplasms/immunology; carcinoma, hepatocellular/immunology; antigens/analysis; apoptosis; immunohistochemistry

abstract

AIMTo study the relationship between the expression of apoptosis-related antigens in hepatocellular carcinoma (HCC) tissues and the localization of apoptotic cancer cells.

METHODSFas, bax, Ice and Bcl-2 immunohistochemistry and in situ end labeling (ISEL) were performed in 30 cases of HCC (during laporotomy). Cells confirmed as apoptosis were ISEL (+) and had typical apoptosis morphology (HE).

RESULTSThe localization of ISEL (+) and apoptosis (HE) were coincident. There were small-piece and massive apoptosis in HCC. Apoptosis could be distinguished from necrosis by ISEL (necrosis negative or weak positive), but both might appear in one area. Apoptotic and healthy cancer cells both had high Fas and Bax expression rates (63.3%， 83.3%)， which were significantly higher than Ice and Bcl-2 and in apoptotic cancer cells, Fas＞Bax, and in healthy cancer cells, Bax＞Fas(P＜0.05). the expression of Fas and Bax in para-HCC and normal liver was lower than in HCC.

CONCLUSIONBoth healthy and apoptotic HCC cells had high expression rates of Fas and Bax. This would support the study of Fas-related immunochemotherapy in HCC.主题词

中国图书资料分类号R735.7

摘要

目的探讨Fas等凋亡相关抗原在肝细胞癌(HCC)的表达及其与凋亡的关系.

方法剖腹HCC30例，标本作Fas，Bax，Ice, bcl-2免疫组化和原位末端标记(ISEL).

结果ISEL与HE的凋亡形态及定位基本吻合，HCC有小片及大片的凋亡；凋亡与坏死形态不同，且坏死ISEL阴性，可与凋亡鉴别.凋亡及健全癌细胞Fas, bax阳性率均较高.癌旁及正常肝的Fas,Bax均较HCC者低. bcl-2在HCC表达甚低.

结论凋亡的HCC组织Fas表达高，较健全癌细胞、癌旁及正常肝组织的表达为高.

0引言

关于人类肝脏肿瘤凋亡(apoptosis)的原位显示及其与凋亡相关抗原关系的报道至今仍罕见^［1］.笔者曾对肝细胞癌(HCC)作过原位末端标记(ISEL)研究，发现其凋亡的发生率颇高，且见有成片性的凋亡^［2］.现进一步作HCC新病例的ISEL及凋亡相关抗原Fas, bax, Ice, Bcl-2的免疫组化研究.

1对象和方法

1.1对象HCC30例，年龄35岁～71岁，男22例，女8例，为本院及附一院病理科近6 a剖腹手术(切除或活检)标本.其中带有癌旁组织者15例；临床上均未作过化疗或放疗.标本经福尔马林固定，石蜡包埋，HE染色.30例均作ISEL及凋亡相关抗原免疫组化.按Edmonson法进行HCC分级；具有文献中描述的调亡细胞HE形态而同时ISEL阳性者，确定为凋亡.

1.2 方法

1.2.1ISEL按Gavrieli et al^［3］方法略加修改.多聚赖氨酸贴片，切片脱蜡入水，20 mL/ L H₂O₂甲醇液阻断，20 ug/ L蛋白酶K37℃消化18min，水洗，中档微波炉(98℃)处理10min，切片浸以自配缓冲液(含30 mmol/ L Tris-HCl，pH7.2， 140 mmol/ L二甲胂酸钠，1 mmol/ L CoCl₂)室温15min，甩去(不洗)后加标记液50μl(含terminal deoxynucleatidyl transferase, TDT 15酶单位；Bio-11-dUTP3 nmol；TDT缓冲液5X.)购自华美公司；37℃孵育2 h，终止反应，PBS5min，20 mL/ l BSA 10min(不洗)，加标准SABC(博士德公司)37℃20min，水洗，DAB显色，苏木素浅衬染，封固.阳性对照：①正常小鼠小肠；②加DNA酶Ⅰ；③过去已证实阳性的HCC.阴性对照：除去TDT.坏死对照：①肝癌梗塞疗法的坏死灶；②淋巴结核.

1.2.2 免疫组化Fas, bax, Ice为亲和纯化多克隆抗体，购自中山公司；Bcl-2为单克隆抗体，购自博士德.切片粘以多聚赖氨酸，脱蜡入水；微波炉修复抗原；Fas, bax, Ice稀释为10 g/ L， Bcl-2为即用型；二抗；SABC；DAB，苏木素浅衬染.对照：①除去一抗，②除去SABC.免疫组化结果是以明显棕色为阳性；按其强度和分布的广泛程度综合评定为+，++，+++级.卡方检验统计.

2结果

2.1HE及ISEL观察HCC30例中Ⅰ级3例，Ⅱ级13例，Ⅲ级13例，Ⅳ级1例.各例均见程度不等的凋亡，呈ISEL核阳性.其中Ⅰ级以单个细胞或小灶性凋亡为多，Ⅱ级以上者既有小灶性亦有大片性凋亡(大于半个低倍视野为大片，最大者可达十多个低倍视野；有大片凋亡者7/30). 凋亡镜下特点是核明显变小，染色加深而靠边(部分仍可见核内结构)，有的凋亡核呈浓染的碎片，不整形小点；整个细胞体积明显缩小，胞浆著明红染，结构欠清或呈颗粒状，但细胞边界尚清楚(后期者界线不清)，最后整个细胞只剩下一小团红染物(但ISEL有时仍可见其内有阳性的核).至于坏死，片中可分为：①典型坏死(大片红染无结构，无核或细胞轮廓可见，常见橙色血晶)；②坏死与凋亡相混杂，即中央为坏死形态，不见核影，边缘部有核浓缩等凋亡改变.典型坏死呈ISEL阴性或弱阳性，其中不见阳性核影；混杂者边缘部ISEL有阳性核(图1-4).此外，我们发现HCC可有早期凋亡(即HE尚未见明显改变而ISEL核阳性)，多为小灶状者；但有一例为大片性.

ISEL对照组结果：正常小鼠小肠的绒毛顶端上皮见核阳性；加DNA酶Ⅰ者全部细胞核均阳性；以前阳性的HCC此次亦阳性；除去TDT者为阴性；梗死HCC灶阴性；淋巴结干酪坏死弱阳性.

2.2 凋亡相关抗原免疫组化结果仅部分HCC或癌旁组织有阳性反应；对照组呈阴性.健全的癌组织阳性率如下：Fas19/ 30(63.3%), Bax 25/ 30(83.3%), Ice 16/ 30(53.3%), Bcl-2 1/ 30. 可见Bax,Fas阳性率较高(Bax与Ice卡方值6.06，P＜0.05).均为胞浆阳性，部分胞膜亦见阳性，核阴性.凋亡的癌组织：经HE与ISEL结合而确定为凋亡的癌组织又可分早期与中后期两种；按范围又有小灶、小片和大片之分.其抗原总阳性率：Fas20/24(83.3%),Bax 18/24(75.0%), Ice 10/24(41.7%), Bcl-2 2/24(8.33%). 可见Fas, bax阳性率较高(Fas/Ice卡方值7.06，P＜0.05；Bax/Ice卡方值6.06，P＜0.05)，同时，二者的阳性强度亦相近(图5-8).癌旁组织：Fas7/15(46.7%)，Bax10/15(66.7%)，Ice13/15(86.7%), Bcl-2 2/15(13.3%). 正常肝3例，除Ice及Bcl-2各一例有阳性外，余阴性(表1).

3讨论

早在1972年Kerr就提出apoptosis的概念并描述了其形态，但直至近年人们才对凋亡有较深的认识.凋亡细胞水平(原位)病理研究的困难在于其如何与坏死相区别.单从光镜形态似无把握肯定凋亡；电镜则受取材和视野小所限.1992年开始采用ISEL以来^［3］，发现该法比较可信.凋亡属于程序性细胞死亡，其主要改变为核DNA链在核小体间连接点处被钙依赖性内源性内切酶所切断，形成180～200bp倍数的DNA断片. dNA末端转移酶(TDT)能将DNA3＇OH断端连接上标记的dUTP，从而将凋亡显示出来.虽坏死亦有DNA断裂，但它是随机性的，且其游离3＇OH末端明显少于凋亡者，故其仅呈弱阳性.若结合形态改变，则二者可以明确区分.凋亡可在肿瘤中或其他病变中大片发生^［2,4,5］.另一困难是凋亡形态可因时相而不同，有时其发生甚速(1.5 h)；凋亡后的细胞一般可被吸收，但若其呈大片性，则浓缩的细胞也可继发性崩解，最后形态上可与坏死无异.有人称此为继发性坏死或凋亡性坏死^［6］.有人建议用oncosis一词代表非凋亡性细胞死亡(即传统坏死概念的早期)，而necrosis一词的含义则改为apoptosis与oncosis的最后共同结果^［7］.有时在同一病灶中坏死与凋亡可以并存或移行的.

众所周知，癌组织中常有坏死，分化差者更多.部分可为凋亡.最近报道注入Fas抗体可直接诱发动物酷似暴发性肝炎的大片肝细胞死亡，并认为这主要属于凋亡^［5,6］. fas/配体系统与肝细胞凋亡关系令人注目.肝细胞Fas的高表达使其易于凋亡.利用Fas抗体可诱导肝细胞凋亡(治疗肝癌)；利用Bcl-2抑制凋亡，则可抵消Fas的作用(治疗重肝).我们发现，凋亡的及健全的HCC均见Fas，Bax高表达，显著高于Ice， bcl-2. 凋亡HCC fas高于健全HCC、癌旁和正常肝.有报告谓HCC中有Fas表达者其凋亡发生率较无Fas表达者高，用流式细胞仪研究HCC的Fas及Bcl-2表达，结果Fas在HCC表达显著高于在非癌肝的表达：癌18%，正常肝4.7%，肝硬变2.5%^［8］.但也有个别实验结果Fas在HCC不见表达者^［1］.文献强调膜性表达对凋亡的重要性；我们亦见膜表达(图6，7).我们见Fas在健全及凋亡癌细胞有高表达，提示用Fas抗体控制人HCC的可能性.作HCC细胞株研究证明，Fas抗体可诱导大量凋亡，尤以有Fas膜表达的细胞株为然.很多化疗药物有Fas机制，这可能是先引起wt p53暂时性积聚，继而Fas上