Subject headingsdigestive system/innervation; myenteric plexus/enzymology; nitric oxide synthase/metabolism; neurons/enzymology; rats, Wistar

abstract

AIMTo investigate the distribution of nitric oxide synthase (NOS) positive neurons in the myenteric plexus of rat digestive tract.

METHODSWith nADPH-diaphorase (NDP) histochemical staining method and whole mount preparation technic, the density of NOS positive neurons was microscopically measured in rat digestive tract.

RESULTSThe nOS positive neurons were distributed in whole myenteric plexus of the rat digestive tract. The size and density of the NOS positive cells did not coincide in different regions. The density (cells/mm²) was 1.8±2.5(esophagus), 31.4±4.7(stomach), 26.4±3.1(duodenum), 29.5±3.9(jejunum), 33.7±4.4(ileum), 6.7±2.3(cecum)，38.6±4.1(ascending colon), 48.7±5.3(descending colon) and 36.2±3.3(rectum). The NOS positive neuro-fiber was also most dense in descending colon and most sparse in esophagus, with similar shape of NOS positive neurons, and obviously different size. Most NOS neurons were inside ganglion, with 2-8 cells in each. Some NOS positive neurons were found to be connected each other to form a network.

CONCLUSIONThe density of NOS positive neurons in different regions of digestive tract coincides with the physiological function of digestive tract. The abnormal distribution of NOS positive neurons may be involved in many gastrointestinal diseases.

中国图书资料分类号R322.85

摘要

目的了解大鼠消化道肌间神经丛中一氧化氮合酶(NOS)阳性神经元的分布规律.

方法采用NADPH-黄递酶(NDP)组化技术在整装铺片上观察了大鼠消化道肌间神经丛中NOS阳性神经元的形态特征并对其分布进行定量研究.

结果整个消化道肌间神经丛中均有NOS阳性神经元分布，密度(个/mm²)分别为1.8±2.5(食管)，31.4±4.7(胃)，26.4±3.1(十二指肠)，29.5±3.9(空肠)。33.7±4.4(回肠)，6.7±2.3(盲肠)，38.6±4.1(升结肠)，48.7±5.3(降结肠)和36.2±3.3(直肠).神经纤维分布仍以降结肠最密集(++++)，食管最稀疏(+). nOS神经元形态基本类似，大小差异较大，绝大部分神经元位于神经节内，每个神经节中NOS神经元2～8个.多数神经元之间有突起相互连接，形成网络.

结论消化道中NOS神经元的分布与该处的生理功能相吻合，并可能与许多胃肠疾病的发生及发展密切相关.

0引言

神经组织中的一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)已被证明就是NADPH-黄递酶(NADPH-diaphase nDP). 因此，应用NDP组织化学染色来显示神经组织中NOS的分布是一种简便的手段而被广泛采用^［1-3］.但有关NOS在整个消化道的分布规律，国内外尚无报道，为此，我们对消化道铺片技术进行适当改进，制成了食管、胃及各肠段纵肌层铺片，应用NDP组织化学法观察了大鼠消化道肌间神经丛中NOS阳性神经元和神经纤维的形态、密度及分布规律，并对其生理意义进行了初步探讨.

1材料和方法

1.1材料健康成年Wistar大鼠5只，雄性，体重200 g～235 g，10 g/ L戊巴比妥钠腹腔麻醉下取出整个消化道，用生理盐水冲净内容物，将食管、十二指肠、空肠、回肠、升结肠、降结肠和直肠分别置于40 g/ L多聚甲醛中固定2 h(4℃). 向胃及盲肠腔内注入40 g/ L多聚甲醛(至正常体积的4～5倍)，再放入该固定液中.0.01 mol/ L PBS(pH 7.3)冲洗2次后移入300 g/ L蔗糖液中4℃过夜，次日行铺片染色(胃的固定和脱水时间应适当延长).

1.2 方法按常规方法^［4］制备肠纵肌层铺片标本，食管铺片方法与肠道类似.在胃底剪一小口将固定液放净，PBS液冲洗干净，用纱布包裹轻揉2min～3min，胃腔用棉花塞紧，用一极薄的竹片沿胃大弯纵轴划痕，从该处向胃小弯方向轻轻剥离，将分离的纵肌层修剪整齐放入PBS中待染，盲肠铺片制作与胃类似，由于盲肠腔较大可直接将食指插入肠腔，帮助剥离纵肌层.将制备好的纵肌层铺片标本用PBS冲洗后，移入由0.1 mol/ L PB(pH 8.0)配制的新鲜孵育液中(0.5 g/ L β-NADPH,0.2 g/ L NBT，2.0 g/ L L-苹果酸，3 g/ L Triton X-100),37℃,45min. PBS冲洗3次后常规贴片、脱水、透明、封片、光镜观察、照像.对照实验：①孵育液中不加β-NADPH；②孵育液中不加NBT；③将铺片加热至80℃，5min，以破坏NOS活性. nOS神经元密度用网式目镜测微器测定，以±s表示(n=30)； nOS神经纤维密度和NOS神经元着色深浅采用目测半定量法，密度按阴性(-)，稀疏(+)，中等(++)，密集(+++)，特别密集(++++)分为5级；着色深浅按阴性(-)，浅蓝色(+)，蓝色(++)，深蓝色(+++)分为4级.

2结果

NDP阳性神经(以下称NOS阳性)呈蓝色或深蓝色，广泛分布于整个消化道肌间神经丛中，并由神经节、节间束及神经纤维纵横交织成网. nOS阳性神经元多为圆形或卵圆形，胞浆着色，胞核不着色，但在消化道不同节段NOS阳性神经元和神经纤维存在较大差异.

2.1 食管肌间神经丛仅在食管下段肌间神经丛中发现NOS阳性神经元，神经胞体较少呈零星分布(1.8±2.5)个/mm²，但着色很深(+++)，以卵圆形为主，部分为三角形和不规则形，神经元有较长的突起，彼此相连形成串珠状结构.该处神经纤维极细，分布稀疏(+)，着色较浅(+)(图1).

图1食管NOS阳性神经元(↑)及神经纤维(▲). nDP×40

图2胃NOS阳性神经元的突起(↑)及NOS阳性血管网(▲). nDP×100

图3空肠神经节(↑)中的NOS神经元及节间束(▲). nDP×40图4盲肠NOS阳性神经元(↑)及神经纤维束(▲). nDP×40

图5降结肠密集的NOS神经元和粗大的神经纤维束. nDP×100

图6直肠NOS阳性血管网(↑). nDP×100

2.2胃肌间神经丛胃壁肌间神经丛中有密集的NOS神经元(31.4±4.7)个/mm²神经胞体以圆形为主，部分为卵圆形或不规则形，但着色较浅(+～++)，神经纤维束较粗，密集(++～+++)分布不规则，神经节和节间束不典型，可见NOS阳性胞体伸出短小突起与其他NOS阳性胞体相连，个别的与NOS阴性神经元相连.在镜下可见许多NOS阳性血管网(图2).

2.3 小肠肌间神经丛小肠肌间神经丛中NOS阳性胞体和神经纤维最为典型，胞体大小、形态基本一致，着色较深(++)，神经元密度(个/mm²)分别为26.4±3.1(十二指肠)，29.5±3.9(空肠)，33.7±4.4(回肠)，NOS阳性胞体多位于神经节中，偶见单个神经元位于节间束中，该处神经纤维较密集(++～+++)，交织成典型的网格结构.在大网格中可见弯曲行走的单根纤维从细束中发出，并形成二级或三级纤维网(图3).

2.4 大肠肌间神经丛除盲肠外，大肠各节段均有丰富的NOS阳性神经元分布，其密度(个/mm²)分别为6.7±2.3(盲肠)，38.6±4.1(升结肠)，48.7±5.3(降结肠)，36.2±3.3(直肠).盲肠中NOS神经元较小，但着色很深(++～+++)，神经纤维束深染(+++)、粗大、但密度较稀(+～++)，并交织成较大的方形网格(图4).而结肠和直肠中NOS神经元大小相差较大，直径10μm～30μm，深染(++～+++)，并具有粗大而密集(+++～++++)的神经纤维束(图5).直肠铺片标本中也可见NOS阳性毛细血管，管壁上有点状分布的NOS阳性物质(图6).

对照实验所有对照实验均为NOS阴性反应

3讨论

由于胃的形态不规则且胃壁肌层较厚，难以制成铺片标本，而普通切片无法观察壁内神经丛的全貌，从而影响了胃壁内神经丛的形态学研究.我们对消化道铺片技术作了适当改进，制成胃纵肌层铺片，并取得了较理想的结果，不仅显示了NOS阳性神经元在胃肌间神经丛中的分布，也为研究其他神经元的分布以及某些神经递质或神经肽的共存关系提供了方法学的借鉴.

实验结果显示，NOS阳性神经元遍布整个消化道，神经元形态完整结构清晰，与文献报道的基本一致^［1-3］.从细胞形态看，多数细胞类似DogielⅠ型神经元，根据形态并结合NO的生理功能，推测NOS神经元为抑制性运动神经元或中间神经元.我们发现食管和盲肠处NOS神经元普遍较小，其余部位的神经元细胞形态基本一致，但大小差异较大，着色深浅不一，推测可能与细胞中NOS活性强弱有关.而在消化道不同节段，神经纤维的形态和密度亦存在较大差异，这是否与消化道不同节段的生理功能有关，有待进一步研究.

消化道