Subject headingsHelicobacter pylori; helicobacter infections/diagnosis; urease/diagnostic use

中国图书资料分类号R517.9

自从1983年Marshall和Warren报道从人胃粘膜活体标本中成功地分离出幽门螺杆菌(Hp)以来，国内外学者进行了广泛深入的研究. 大量资料认为，Hp是慢性胃炎和消化性溃疡的重要致病因素之一，与非溃疡性消化不良和胃癌也有一定的关系. 检测Hp的方法有多种，按是否需要内镜取材分为侵入性和非侵入性检查. 前者包括组织病理学检查、尿素酶试验、细菌培养及基因探针技术；后者包括血清学检查、¹³C及¹⁴C尿素酶呼吸试验. 对上述检测方法进行较全面而客观 的评价，以期对临床工作者在选用检测方法时能有所裨益.

1细菌培养法

该方法是诊断Hp的“黄金标准”. Hp分离培养关键在于及时处理标本、培养基和培养条件的选择^［1］. 研究表明，Hp在普通培养琼脂、胰蛋白酶消化大豆、Bruella以及单纯的脑心液等培养基中均不生长，而在这些培养基中加入5%～8%马血清、羊血清或胎牛血清、兔血或羊血方能生长^［2］. 可用于Hp分离的培养基很多，总的可分两大类：一类是非选择性培养基，一类是选择性培养基^［3］. 实践证明，二者均可分离培养Hp，相比之下，后者优于前者，不仅菌落偏大，而且不易生长杂菌. 选择培养基常用Skirrow培养基和MTM(Modified Thayer-Martin)培养基，此类培养基的选择应取决于其中所加的抑制其他菌生长的抗菌物质，如万古霉素(抑制G⁺菌)、多粘菌素(抑制G^-菌)、两性霉素(抑制霉菌和酵母菌)、TMP(抑制变形杆菌)、萘啶酸(抑制其他弯曲菌).

Hp对pH的耐受范围为4～10，Shadowen et al^［4］通过实验认为pH 8.5±0.5条件下Hp生长最佳. Hp为微需氧菌，在空气中及绝对无氧环境中均不能生长，在含5%～6% O₂、8%～10% CO₂、80%～85% N₂的 气体环境中生长较好^［5］，一般采用抽气—充分法满足其需要. Hp在30℃～40℃环境下生长，最适宜温度是35℃～37℃，其生长缓慢，一般需5d左右.

活检组织的接种主要有四种方法^［2］：①将活检组织剪碎或用乳钵研磨后接种；②活检组织加水于无菌河沙研磨，经1000rpm离心5min，取上清液再以3500rpm离心30min集菌、去上清，取沉淀物接种；③用活检组织的粘膜上皮直接接种；④将活检组织多面直接在分离培养基轻轻压印，然后用接种环划线.

该方法能直接证明Hp的存在，无假阳性出现，可作细菌药敏及耐药试验， 可对不同菌株作遗传因子研究. 但其要求的条件和技术较高，且需一定的时间，有时可有假阴性出现.

2尿素酶试验

1984年Langenberg发现Hp能够产生大量的尿素酶，该酶具有很高的酶活性，对Hp具有自身保护作用. 它水解尿素，生成氨和二氧化碳，氨能在Hp菌体周围形成一层“氨云”，对抵御胃酸的杀菌作用具有重要意义. 基于此原理，目前已设计了多种检测方法.

2.1pH指示剂法试剂中含尿素和pH指示剂(如酚红). 从胃内取出的组织活检标本通常呈酸性，pH＜6.0，一般情况下试剂颜色不变. 如果胃内有Hp感染，当标本放入试剂中，Hp所产生的尿素酶则分解尿素产生氨，使pH值升高，导致指示剂酚红变色—粉红色. 1988年，Arvind报道了1min尿素酶试验. 即，用无离子水配制100%的尿素溶液，分装在小管内，每管为1ml加入1%的酚红2滴，pH 6.8，1min看结果，未见假阴性，敏感性为91%. 由于反应时间短，避免了产生尿素酶的污染菌繁殖所致的假阳性. 现国内大部分已应用此方法进行Hp感染的诊断，多采用深圳爱利国医学科开发有限公司生产的1min尿素酶试剂(One-minute urease reagent)及兰州军区卫校生产的尿素酶试剂反应板.

2.2分析化学法福建三强生化有限公司生产的 cpuP试剂盒属于此种方法，由于阳性显色反应不是取决于试剂中pH改变，可以避免一些影响pH的因素所致的假阳性，敏感性98.6%，特异性100%.

尿素酶试验方法简便实用、快速灵敏，能在1min内判断结果，且镜检完后就可及时治疗. 缺点是有一定的假阴性和假阳性，且不能用于治疗后疗效判断.

3组织病理学检查

方法较多，有HE染色、Warthin-Starry染色、Giemsa染色、石炭酸复红染色、Gimenez染色、吖啶橙染色、阿的平荧光染色、间接免疫荧光法、相差显微镜观察、无标记抗体PAP染色法、寡核苷酸探针检查等方法. 以Warthin-Starry染色效果最佳.

该检测方法繁琐费时，需要一定的技术，有一定假阴性，且敏感性及特异性较差.

4呼吸试验

由于Hp在体内产生大量的尿素酶，因此若给感染Hp的患者口服同位素标记的尿素溶液，则尿素分解后产生的同位素CO₂从肺呼出，可收集呼气样本，用液体闪烁计数器或用气体同位素质谱仪检测同位素CO₂的量，根据标记物不同，分为¹³C呼吸试验及¹⁴C呼吸试验.

4.1¹³-C呼吸试验

1987年，Graham和Bell首先报道了用该试验诊断Hp感染. 受试者口服¹³C-尿素酶，每公斤体重5mg，随后每10min收集一次呼气标本，连续3h. 如胃内有Hp感染，口服的¹³C-尿素溶液在尿素酶的作用下分解成¹³CO₂，经胃肠道吸收后随呼吸呼出，收集的气体标本质谱仪分析，计算¹³CO₂含量. 有Hp感染者在口服试剂后20min即出现¹³CO₂升高，在100min内持续升高，而无Hp感染者无¹³CO₂呼出.

4.2¹⁴C-呼吸试验为了克服¹³C-呼吸试验操作复杂、费用昂贵的缺点，Marshall等用¹⁴C-尿素代替¹³C-尿素，检测¹⁴C用液体闪烁计数器即可. 此法也是让患者服用¹⁴C-尿素110～400KBg，收集气体的时间一般从30min至2h. 敏感性89%～100%，特异性 达92%～94%.

呼吸试验快速、可靠、安全、无痛苦，国外已将其作为追踪观察治疗效果的最好方法，适合于大规模流行病学调查，表明目前是否有Hp感染， 而不是曾否感染过. 缺点是需要特殊设备，试剂昂贵，对残胃患者，因排空加快可致假阴性.

5血清学检测

为一种非创伤性的检测方法，国内外学者对此研究较多，主要包括以下几种^［6］：

5.1尿素酶抗体的检测由于Hp富含尿素酶，故以尿素酶为抗原采用ELISA检测患者血清中特异性尿素酶抗体. 国外Karnes^［7］报道其特异性为100%，敏感性93%. 此检测对慢性胃炎的诊断有一定价值，但国内尚鲜有报道.

5.2N-乙酰神经氨结合凝集素(NLBH)抗体的检测Evans et al^［8］从无症状者和分离出的Hp 8826株中提纯NLBH，经证实无尿素酶活性，以此为抗原，行ELISA检测了187例血清，结果发现特异性 88.3%，敏感性75%，消化性溃疡者81.5%可检出NLBH抗体. 故NLBH抗体的检测有可能作为溃疡活动性的指标.

5.3单克隆抗体的应用Sugiyama et al^［9］发现三株特异性很高的Hp单抗，其中单抗HP₃特异性识别Hp抗原25kd. 以单抗CP₃纯化的25kd蛋白为抗原应用ELISA检测Hp感染的患者血清，结果特异性100%，敏感性96.9%，且慢性胃炎、胃溃疡和十二指肠溃疡患者CP₃抗体滴度明显升高，CP₃滴度与胃炎组织分级显著相关. 故认为检测CP₃抗体可作为胃炎分级的指标.

5.4菌体抗体的检测补体结合试验、细菌凝集试验、被动血凝试验(PHA)等方法由于敏感性、特异性、可靠性较差，目前已很少采用. 间接免疫荧光法(IF)简单、快速、敏感性和特异性高，可以弥补培养法由于Hp弱、培养过程污染或培养基等因素所致培养阴性不足. 但由于需荧光显微镜，广泛应用受到限制. 免疫印迹法(Immunoblot)^［10］是取数株Hp整菌溶解物经SDS-PAGE电泳所得蛋白转移至硝酸纤维薄膜，取受检血清2ml与薄膜在摇动下室温过夜，洗涤后再分别以碱性磷酸酶标记的兔抗人IgG、IgA和IgM检出与血清中抗体结合的区带. 研究认为，应用此法检查血清IgG和IgA抗体可以肯定诊断感染. 适合于不能作内镜者诊断Hp感染和易感人群的筛选. 但该法操作繁琐，所显示的区带常常不恒定和不特异，给结果判断带来困难. 酶联免疫吸附试验(ELISA)是目前临床应用最多的方法，其敏感性高、特异性强、稳定性好，可检测不同类型的抗体. Perez-Perez et al^［11］用超声粉碎物作抗原，结果抗Hp-IgG、IgA抗体特异性94.4%，敏感性93.1%，而IgM则无特异性. 目前国内外均已有抗Hp抗体试剂盒供应.

由于人群中Hp的感染率在50%以上^［2］，其中约一半的Hp含有细胞毒素相关蛋白基因A(cagA). 可产生细胞毒素相关蛋白A(CagA)的Hp菌株的感染与消化性溃疡的发生有较高的相关性，有些学者甚至认为抗CagA阳性可作为消化性溃疡的一项参考指标. 在胃癌中CagA阳性Hp的感染率也很高，多数报道在95%以上. 发展快速及特异性