li XG, Xie JY, Lu YY

Suppressive action of garlic oil on growth and differentiation of human gastric cancer cell line BGC-823^*

lI Xiao-Guang¹, XIE Jin-Yu² and LU You-Yong³¹China Rehabilitation Research Center, Beijing 100077, China²China Academy of Traditional Chinese Medicine³Beijing Institute for Cancer Research

Subject headings garlic oil; cell differentiation; cofocal; p21/WAF1 gene

Abstract

AIM To study the mechanism of garlic oil on differentiation of human gastric cancer cell BGC-823.

METHODS We used cofocal microscopy and Northern blot hybridization techniques to analyze the BGC-823 cells treated with or without 50 mg/L garlic oil in vitro for one week.

rESULTS The growth and tumorigenicity were inhibited dramatically in the cells treated with garlic oil, and high level expression of WAF1/p21 and wild type p53 gene and was detected.

cONCLUSION The differentiation of BGC-823 cell can be induced with garlic oil, and p21 and p53 gene possibly plays an important role in the process.

主题词 大蒜油(GO)；细胞分化；激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)；p21/WAF1基因

中国图书资料分类号 R

摘 要

目的 从细胞和基因水平阐明大蒜油对人胃癌BGC-823细胞的作用机制.

方法 用激光扫描共聚焦显微镜及Northern杂交等技术进行分析.

结果 大蒜油对癌细胞形态、增殖和致瘤性有明显影响.

结论 首次发现大蒜油对肿瘤细胞的作用是通过影响p53,p21等的表达水平.以上结果提示大蒜油有诱导肿瘤细胞分化的作用.

0 引言

大蒜在我国民间药用已有三千多年的历史.在《本草纲目》和《验方新编》中就有其药用价值的精辟记载^［1］.现代基础研究和临床实验证明大蒜有良好的防癌、抑癌作用^［2］.近十年来，在国际范围内，许多肿瘤工作者对大蒜防癌、抑癌作用给予了高度重视. 大蒜有效成分对肿瘤细胞有明显的抑制作用.我国科学工作者在胃癌高低发区的流行病学资料表明，食用大蒜地区人群中胃癌发病率比全国平均水平低6倍，比高发区低10倍^［3］.大蒜油是一种具有抗肿瘤作用的天然成分，我们在以往的实验研究中观察到大蒜油对多种肿瘤细胞有十分明显的杀伤和增殖抑制作用，在此基础上用激光扫描共聚焦显微镜观察大蒜油处理后肿瘤细胞断层扫描，三维结构等的变化.利用细胞和分子生物学技术进一步证明其具有诱导肿瘤细胞分化的作用.分析了大蒜油对肿瘤细胞基因表达的影响，以期深入了解大蒜油抗肿瘤的作用机制.

1 材料和方法

1.1 实验药品 大蒜油，中国中医研究院基础理论研究所研制. 取大蒜油1 g，吐温802 g和生理盐水100 ml制成10 g/L大蒜油乳剂，4℃冰箱保存.给药剂量为50 mg/L.

对照组用生理盐水或20 g/L吐温80溶液.

1.2 细胞培养及细胞形态学观察 人胃癌BGC-823细胞用含10 ml/L小牛血清DMEM培养基，在37℃，50 ml/L CO₂条件下培养，细胞培养至80%融合时，更换培养基并加药，处理7 d后释放药物，进行实验. 并用光学显微镜观察.

1.3 激光扫描共聚焦显微镜观察 用激光扫描共聚焦显微镜(美国Meridian公司)以数值孔镜为1.3的100倍油镜观察. 激光输出谱线488 nm蓝光，输出功率5 mW. AO双染(吖啶橙)^［4］，绿色荧光通过530/30，红色荧光通过583/20带通滤光片探测，Z轴方向由细胞项部至底部0.6 μm步进式“切片”，对人胃癌BGC-823细胞进行断层共聚焦扫描成象；采集的共聚焦图象经InSIFHT专业图象板图处理，用InSIGHT计算机 iQ软件做三维重建.

1.4 裸鼠致瘤性分析 Balb/c裸鼠，雌性，5周龄，9只. 生长状态良好的细胞以胰酶消化，计数. 培养基洗涤2次后用0.1 ml无血清培养基悬浮.裸鼠双侧背部皮下注射5×10⁵细胞，左侧注射待测细胞，右侧注射人胃癌BGC-823细胞作对照.连续观察肿瘤出现时间和体积.

1.5 Northern杂交分析 大蒜油处理的人胃癌BGC-823细胞，采用酸性酚-异硫氰酸胍法提取细胞总RNA. 细胞以Solution D(含4 mol/L异硫氰酸胍，50 mmol/L Tris pH 7.6, 10 mol/L EDTA， 20 g/L肉桂酸，0.1 mol/L 2-巯基乙醇)裂解，经酸性酚、氯仿/异戊醇抽提后，异丙醇沉淀，再溶于适量RNA Denaturing Buf中，酸性酚以

0.2 mol/L NaOAc, 0.1 mmol/L ATA(aurint ricarboxylic acid,金精三羧酸)，pH 4.0饱和^［5］.

总RNA经12 g/L琼脂糖凝胶电泳分离，用毛细法将分离后的RNA由凝胶转移至尼龙膜上. 缺口翻译或随机引物标记并纯化p53,p21 cDNA探针，42℃旋转杂交24或48 h，洗膜后晾干，-70℃X光曝光3 d～14 d.

2 结果

2.1 大蒜油抑制癌细胞的生长和促分化作用 体外培养的BGC-823细胞经50 mg/L大蒜油处理48 h后即可显著抑制细胞的生长，在光学显微镜下观察，细胞形态发生明显变化. 细胞变得较平坦，呈多角形，核/质比例降低，细胞间隙不象癌细胞那样界限分明，而是近似正常细胞间隙不明显.所观察的全部对照组细胞包括生理盐水、20 g/L吐温80组，各个时间观察，细胞形态与普通对照组细胞相比无明显改变.激光扫描共聚焦显微镜三维图象分析大蒜油处理后的细胞变化：①对照组BGC-823细胞光切片断层扫描观察：如图1所示，(A)为对照组细胞中间的核显黄绿色荧光为DNA，周围的胞质显示红色荧光为RNA，细胞整体呈多角形，核大而圆. (B)为用药2wk后，可见细胞形态明显变化，核/质比例降低. ②大蒜油对BGC-823细胞染色体结构的作用：如图2示：(A)示三维重建显示DNA荧光强度分布的立体图象，形似一个完整的蛋糕形，其项部荧光强，相当于核中央，底部弱，相当于核周边.反映出从橙红→黄→浅青→蓝色不同颜色，右侧有颜色标尺说明荧光强度变化. (B)示三维重建DNA荧光强度分布图上，可见细胞核DNA缺损，荧光变弱.

图1 激光扫描共聚焦显微镜显示BGC-823细胞的形态 (A)对照 (B)GO处理2 wk图2 激光扫描共聚焦显微镜显示BGC-823细胞DNA荧光强度及分布 (A)对照

(B)GO处理2 wk图3 GO处理BGC-823细胞的裸鼠致瘤性分析 左侧接种经GO处理的细胞(▲)

右侧接种对照组细胞（ )

图4 GO处理BGC-823细胞的p53基因 Northern杂交分析 (1)100 mg/L,

(2) 50 mg/L, (3)空白对照图5 GO处理BGC-823细胞的p21基因 Northern杂交分析 (1)100 mg/L,

(2) 50 mg/L, (3)空白对照

2.2 大蒜油抑制裸鼠致瘤性作用 裸鼠致瘤性结果显示接种经大蒜油处理的细胞4 wk内全部无肿瘤形成. 而对照组2 wk内全部有肿瘤形成(图3).

2.3 大蒜油影响肿瘤基因的表达 用50 mg/L大蒜油处理BGC-823细胞2 wk，与未处理的对照组比较，表现出p53(图4)和p21(图5)基因表达增强.

3 讨论

大蒜抗肿瘤作用在临床上已得到证实，特别在肿瘤的预防方面具有十分重要的作用.我国明代医药学家李时珍在《本草纲目》中就详细的论述了大蒜的药用价值，认为大蒜具有“消谷化肉，散痛肿、除风邪、杀毒气、除风湿、疗疮癣、健脾胃、活肾气、止霍乱、解温疫”^［1］等各种作用.大蒜油(GO)是大蒜的主要有效成分.大量的药理实验证明，大蒜油具有较强的抗癌作用. 使用大蒜油100 mg/kg体重，腹腔局部注射，就能完全抑制U14使和S180癌细胞的有丝分裂，使大部分癌细胞在形态上发生核碎裂、核固缩，细胞质空泡化等肿瘤细胞的退行性变化^［4］.为了进一步阐明大蒜在防治肿瘤过程中的作用及机制，我们从细胞和基因水平上分析了大蒜油对体外培养的人胃癌细胞的影响.

本研究结果表明，50 mg/L大蒜油可明显抑制癌细胞生长，细胞形态结构发生类似正常细胞的显著变化，而且停止使用该药1 wk后继续保持其稳定的表型.

将经大蒜油诱导分化的细胞进行裸鼠致瘤性分析，结果该细胞的致瘤性全部消失. 说明大蒜油对癌细胞的作用是一种促分化效应而非细胞毒效应.细胞分化是指同一来源的细胞通过分裂逐渐<