国外医学消化系疾病分册1999年第19卷第4期

上海第二医科大学附属仁济医院、上海市消化疾病研究所（20001）郜恒骏（综述）任卫平萧树东（审校）

摘要痘苗病毒作为疫苗曾广泛应用于预防天花的全球性接种。近年来，该病毒又作为一种基因表达载体，在肿瘤基因治疗研究中起重要作用，且较其他病毒载体系统具有多种优点。本文综述了痘苗病毒作为基因工程载体的构建及在消化道肿瘤基因治疗中应用的现状。

关健词：痘苗病毒载体消化道肿瘤基因治疗

消化道恶性肿瘤的基因治疗已成为目前研究的热点之一。基因转移是基因治疗的关健和基础，寻找高效、安全的载体表达系统是基因治疗研究中的重点和难点。痘苗病毒（vaccinia virus,VV）作为基因治疗的载体系统之一正越来越受到人们重视^[1]，已成为继逆转录病毒和腺病毒之后作为基因治疗载体的又一研究热点。本文就VV在消化道肿瘤基因治疗中的应用现状作一综述。

1重组痘苗病毒（rVV）载体的构建

在VV非必需区（有J片段的TK基因、有位于HindⅢA片段的HA基因）的基因克隆片段中间插入外源基因（此基因应是连续的），使外源基因置于VV启动子的下游，而且基因的转录方向与启动子的方向一致，而外源基因序列的两侧具有与野毒株病毒DNA的同源序列。将此重组质粒转染入在1～2小时前已经野毒株感染的细胞中，这样插入的外源基因两侧带有同源序列的DNA，与野毒株DNA之间发生同源重组，就获得带有外源基因的全痘苗病毒DNA，经包装成rVV颗粒。rVV可以感染敏感的宿主细胞进行表达^[2]。

2rVV载体在消化道肿瘤基因治疗中的应用

2.1 目的基因的选择

目前肿瘤基因治疗中常用的治疗性基因主要有以下3类:（1）直接杀伤或抑制癌细胞生长的基因，包括抑制基因如p53等、癌基因的反义序列、“自杀”基因如胸苷激酶基因（tk）；（2）可提高免疫系统能力的基因，如细胞因子的编码基因IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、IFN等；（3）免疫相关基因，如B7-1、B7-2、MHC i类抗原、ICAM-1、CEA等；（4）多种药物的耐药性基因。

2.2 消化道肿瘤的基因治疗

用rVV作载体的消化道肿瘤基因治疗中所用的目的基因主要有IL-2^{[13，14，19]}、IL-12^[17]、B7^[7，8]、GM-CSF^[6，19]、CEA^[3]、JCAM-I^[7]等以及它们的联合应用^{[4，11，12]}，其中研究最多的结肠癌的基因治疗。

2.2.1 结直肠癌

McAneny^[3]等报道了表达CEA的rVV治疗进展期结、直肠癌的I期临床试验结果。17例进展期结、直肠癌共接种44次，轻度的局部和全身反应多发生在第一次接种，无1例发生rV-CEA引起的并发症或死亡，尤其是未发生自身免疫性结肠炎。尽管CEA和白细胞抗原之间具有一些同源性，也未见白细胞减少，所有接种者均有良好的耐受性，由此证明了rV-CEA在结肠癌治疗中的安全性。McLughlin^[4]等研究了IL-2与rV-CEA联合应用的效果。给ECA阳性结肠腺癌C57BL/6小鼠单用rV-CEA接种，大约20%小鼠的肿瘤完全消退，如果加用低剂量的IL-2则有60%～70%小鼠的肿瘤完全消退。此外，IL-2与rV-CEA联合应用可保护肿瘤已消退的小鼠抵抗表达CEA的肿瘤细胞再次挑战。单用IL-2或野生型VV未见肿瘤消退和保护作用。与单独应用rV-CEA接种组相比，联合应用显著增长了CEA特异性T细胞和细胞毒T细胞的免疫反应，故认为IL-2可显著增强rV-CEA的效果。

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM—CSF）是目前细胞因子修饰肿瘤细胞中最热门的基因。GM-CSF除增强粒细胞、巨噬细胞的活动性功能外，尚可作为免疫调节剂增强包膜表面受体MHCⅠ、Ⅱ类分子的表达和粘附分子B7的表达，并增强抗原递呈细胞的成熟及功能，尤其是骨髓的树突状细胞^[5]。McLaughlin^[6]等用rV-GM-CSF感染免疫原性弱的鼠结肠腺癌细胞系MC-38。用感染了rV-GM-CSF的MC-38肿瘤细胞接种后完全抑制了MC-38原发肿瘤的生长。肿瘤的抑制依赖于CD4⁺和CD8⁺T细胞亚群的出现。抗肿瘤效果的产生与感染rV-GM-CSF的肿瘤细胞旁分泌具有生物学活性的鼠GM-CSF有关，后者可增强免疫原性弱的鼠肿瘤内在免疫原性。研究还证实，这种免疫力是长期持续的，且是抗原特异性的，因为rV-GM-CSF接种的鼠能抵抗MC-38的挑战，但不能抵抗另一型肿瘤细胞的挑战。然而，表达IL-2或IL-6的rVV感染了MC-38肿瘤细胞后却无抗肿瘤效果^[4，6]。

根据细胞激活的双信号学说，第一信号是抗原与T细胞受体的结合，第二信号则由一组独立的受体和共刺激分子所介导，这些共刺激分子包括ICAM-1（CD54）、IFA-3（CD58）、VCAM-1、B7家族（B7-1、B7-2）和热稳定抗原等。肿瘤细胞缺乏共刺激分子或粘附分子而逃避宿主的免疫反应。用rVV导入共刺激分子，如ICAM-1、B7家族等基因可增强肿瘤细胞的免疫原性^[7，8]。Uzendoski^[7]等用rVV-ICAM-1感染I-CAM-1阴性的MC-38结肠癌细胞系，将I-CAM-1暂时导入该细胞，结果发现:（1）用rVV-ICAM-1感染后，MC-38肿瘤细胞上I-CAM-1以本来形式被合成，且在上清液中可测到非溶解型ICAM-1蛋白；（2）被rVV-ICAM-1编码的MC-38肿瘤细胞上ICAM-1功能性表达存在。通过rVV-ICAM-1能提供并介导产生有效细胞因子产物（如TNF）的适当信号；（3）rVV-ICAM-1感染的MC-38肿瘤的同源C57BL/6鼠也能对抗在远侧的ICAM-1野生型MC-38肿瘤细胞的再次侵袭。该研究表明，rVV（表达ICAM-1基因）能快速感染肿瘤细胞（1～4小时）且高效率表达重组蛋白（超过93%的细胞）。感染的细胞的确显示出以二壳粒形式合成的重组蛋白，导致抗肿瘤效果产生和免疫记忆确立。另有研究^[9]发现，B7-1和allo-class i的转染能诱导强烈的肿瘤特异性细胞毒T淋巴细胞（CTL）反应，GM-CSF、IL-12与IL-2可诱导混合性非特异性及特异性反应，但B7-2与classⅡ转染无效。Hodge^[8]等用重组B7-1和B7-2VV（rV-B7和rV-B7-2）感染BSC-1细胞导致细胞表面B7-1和B7-2快速而有效地表达（4小时，超过97%细胞表达）。将rVV-B7-1或rVV-B7-2感染的肿瘤细胞接种于有免疫活性的动物，结果无肿瘤生长。因此认为，应用rVV输入B7分子到肿瘤细胞是一种基因治疗和肿瘤免疫治疗的潜在途径。但有研究表明，B7-1和B7-2共转染的效果并不优于转染单个基因的效果^[10]。

单用B7-1或B7-2常不能增加全身的免疫力，联合共刺激分子B-7和细胞因子，如IL-2、GM-CSF等可有效地激发机体的全身免疫力^[11]。Sivanandham^[12]等用复制缺陷的VV编码B7-1和IL-2制成结肠癌细胞疫苗以诱导同源鼠的抗肿瘤反应。去掉VV基因组中18开放阅读框而形成复制缺陷的VV、NYVAC。在体外准备编码鼠T细胞共刺激分子B7-1（CD80）基因（NYVAC-B7-1）和鼠IL-2基因（NYVAC-IL-2）的NYVAC，且分别证实B7-1的表达和IL-2的分泌。用同源鼠CC-36结肠腺癌模型研究瘤苗的效果。分别用1×10⁷pfu nYVAC-B7-1、NYVAC-IL-2或对照病毒NYVAC-HR感染照射后的CC-36细胞，取1×10⁶的受染细胞于第1天和第8天给鼠接种，第15天给鼠接种1×10⁸存活的CC-36肿瘤细胞。4周后，未接受免疫处理组（10/10）和接受CC-36/NYVAC-HR免疫处理组（20/20）的所有鼠均有肿瘤发生。有趣的是，CC-36/NYVAC-B7-1组20只鼠中16只有肿瘤发生，其肿瘤的平均直径与未免疫和CC-36/NYVAC-HR组相比有显著差异，分别为6.5mm±3.2mm,26.5mm±0.9mm和26.2mm±1.8mm(p＜0.05)。但CC-36/NYVAC-IL-2组与上述两组相比却相似。然而，CC-36/NYVAC-B7-1或CC-36/NYVAC-IL-2组肿瘤植入后平均生存期显著长于未接受免疫组，分别达60余天、60余天或23.5天（P＜0.01）。更为有超有是，肿瘤植入鼠体内4天后，无论是接种CC-36/NYVAC-IL-2，与未接种组相比，鼠的平均生存期均未改善，分别为28天、26天和25天。若将两种瘤苗同时接种，则平均生存期显著长于未接受免疫组，分别为29.5天、25天（P＜0.05）。结果显示，编码B7-1基因和IL-2基因的重组NYVAC是有效的抗肿瘤疫苗。

编码目的基因rVV对结肠癌肝转移也有一定的效果^[13～15]。Sivanandham^[13]等用rVV-IL-2制备的鼠结肠腺癌（CC-36）溶解剂（IL-2VCO）治疗同源的CC-36伴肝转移。与对照组相比，治疗组肝肿瘤显著地减小了，生存期有所延长。在此基础上，加用IFN-α（IL-2VCO加IFN-α）则CC-36肝转移鼠的生存率显著提高（90%达肿瘤植入后60天），而单用IFN-α、VCO加IFN-α或IL-2VCO组分别为0%、0%或11%，与此组生存率相似的是VCO加IL-2加IFN-α组（67%）。其原因在于CC-36肝转移显著减少，平均肝重量及肿瘤结节平均数分别为：IL-2VCO加IFN-α组1.31g、2；IL-2VCO组1.58g、11；VCO加IFN-α组1.96g、53和IFN-α组2.24g、91。IL-2VCO与IFN-α联合应用诱导产生更强的抗CC-36肿瘤细胞的细胞毒T淋巴细胞活性，尤其是CD⁺的T细胞^[14]。近来，Akagi^[15]等报道用重组MUC-1 vV（rV-MUC-1）能诱导结直肠癌患者产生抗MUC-1的细胞毒T淋巴细胞，且主要为HLA非限制性的细胞毒CD8⁺T细胞，与体内抗肿瘤活性增加有关，导致肝转移显著减少。

2.2.2 胰腺癌

IL-12是一个异二聚体，由p40和p50两个亚单位组成，是强有力的宿主抗肿瘤免疫的诱导剂，其作用是通过IFN-<