关键词： 结核；母牛分支杆菌菌苗；干扰素；白细胞介素4；诱导型一氧化氮合酶

摘要：目的从分子病理学角度探讨母牛分支杆菌菌苗（以下简称母牛菌苗）的免疫调节机制。方法将BALB/C小鼠随机分为3组：单纯攻毒组(A)、母牛菌苗免疫攻毒组(B)和正常对照组(N)。经尾静脉注射H₃₇R_V建立结核病小鼠模型，母牛菌苗由腹腔注射。肉眼观察肺脏病变指数并采用免疫组化染色和常规HE染色,探讨IFN-γ、IL-4、iNOS表达与肺脏组织损伤的类型和程度的关系。结果结核病小鼠病变弥漫，伴有灶性干酪坏死，免疫组织化学染色结果显示在炎性渗出及肉芽肿内IFN-γ阳性细胞随时间推移逐渐增多，至第6周达高峰（0.058±0.010），与正常对照组比较有非常显著性差异（0.005±0.020，P＜0.01）。此后为Tho平衡期，在肺损伤组织中IFN-γ和IL-4阳性细胞基本相当。iNOS表达在急性期增多慢性期减少。母牛菌苗免疫攻毒组小鼠肺组织病变，以增殖结节、淋巴样结节为主，未见坏死病变，免疫反应表现为：感染全过程中以Th1应答为主，即IFN-γ阳性细胞逐渐增多，第8周达高峰（0.058±0.010），IL-4阳性细胞一直维持在低水平，未出现Tho平衡期。iNOS表达一直维持在高水平。结论母牛菌苗调节结核病小鼠免疫的可能机制为：启动Th1应答，抑制Th2应答，激活iNOS活性，增强机体保护性免疫。

Mycobacterium vaccae influences the kinetics of Th1/Th2 cells and expression of iNOS in a marine model of experimental tuberculosis

ZHANG Liqun

(Beijing Chest Hospital, Beijing 100095, China)

MA WeiluDA Jiping

Abstract：ObjectiveTo investigate the immunoregulative mechanism of Mycobacterium vaccae by way of molecular pathology.MethodsBALB/C mice were randomly divided into three groups: tuberculosis model (A); mice were challenged with H₃₇R_V by their tail veins and then immunized by M. vaccae (B); control mice (N). Immunohistochemistry and pathological slices stained with HE were evaluated to investigate the correlation between the expression of IFN-γ,IL-4 and iNOS and the type and magnitude of tissue injury.ResultsA predominance of Th1 cells was observed manifested by a high percentage of IFN-γ positive cells in the inflammatory infiltrate and granulomas demonstrated by immunohistology peaked 6 weeks after infection (0.058±0.010), and there was a significant increase compared with N group (0.005±0.020，P＜0.01). This was followed by a chronic advanced phase characterized by pneumonia local necrosis with a Tho balance due to an equivalent proportion of IFN-γ and IL-4 positive cells in the lung lesions. The iNOS expression was increased in acute phase and decreased in chronic phase. B group had localized lung lesions, proliferate and lymphoid nodules were predominant, there was less necrostic change. A predominance of Th1 cells was observed during the infection changed over time and there was no Tho balance phase occurred. iNOS expression had a higher level during the wholecourse of infection.ConclusionM.vaccae can enhance the protective immunological response by inducing Th1 response and inhibiting Th2 response.

Key words：Tuberculosis；Mycobacterium vaccae；Interferon-γ；Interleukin-4；Inducible nitric oxide synthase▲

随着细胞免疫学、分子生物学的进展，人们对结核病的认识发生了深刻变化。研究表明：小鼠感染结核分支杆菌后产生有效的抗菌免疫需要一系列T淋巴细胞和巨噬细胞（Mφ）的共同作用，包括T细胞抗原识别受体αβ⁺及γδ⁺T细胞，CD^＋₄和CD^＋₈T细胞的激活。同时，细胞因子尤其是干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-γ（TNF-γ）和白细胞介素4(IL-4）及活化M内产生的活性氮中介物等也是抗菌免疫的关键^［1,2］。多种细胞因子的发现及其在结核病发病过程中的重要作用，为结核病免疫病理学及免疫治疗学的深入研究开辟了新路^［3,4］，有关结核病病理和免疫学相关性的深入、系统的分子病理学研究，尚需深入进行。在治疗措施方面，由于耐多药结核病的不断增多及药物毒副作用等诸多因素，抗结核治疗面临巨大挑战，结核病的免疫治疗成为又一研究热点。母牛分支杆菌菌苗（以下称母牛菌苗）是WHO在其90年代结核病研究与发展战略规划中推荐的唯一免疫治疗剂，10余年来我国学者对其进行了多方面的研究^［5-7］，但母牛菌苗对Th1/Th2细胞动力学及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达与病理改变的相关性及对发病机制的影响尚未见报道。

我们在建立小鼠结核病模型的基础上，给予母牛菌苗免疫注射，采用免疫组织化学法观察小鼠肺组织IFN-γ、IL-4及iNOS的定位和表达变化，旨在进一步探讨母牛菌苗的保护性免疫作用机制。

材料与方法

一、材料

1.实验动物：BALB/C小鼠，雌雄各半，体重18～20 g，购自卫生部生物制品研究所。

2. 抗体：抗鼠IFN-γ和IL-4单克隆抗体购自晶美生物工程有限公司(美国Endogen公司产)。抗iNOS多克隆抗体购自美国Santa Crus公司。

3. 药品：母牛菌苗由卫生部生物制品检定所馈赠。

4. 实验动物房：由北京结核病与胸部肿瘤研究所提供二级动物房。

5.主要生化试剂：免疫组织化学染色采用北京中山生物技术有限公司的SP试剂盒。

6.CMIAS真彩色图像分析系统由解放军空军总医院提供。

二、方法

1. 实验动物分组：将实验动物随机分为以下3组：结核病模型组（24只，A），感染后母牛菌苗免疫组（24只，B）及正常对照组（24只，N）。

2. 结核病小鼠模型的建立：取在改良罗氏培养基上生长良好的结核分支杆菌H₃₇R_v 2周的培养物，用玛瑙乳钵磨成10 mg/3 ml的均匀菌悬液（含0.05％吐温80的灭菌生理盐水溶液），用生理盐水稀释成1 mg/3 ml的菌悬液，于每只小鼠尾静脉内注射0.3 ml（相当于湿菌0.1 mg/只），含菌量单位10⁶/只。

3. 母牛菌苗的给药方法：于攻毒后10天腹腔内注射母牛菌苗22.5 μg／只。

4. 观察指标：(1) 肺部病变指数：肉眼观察各组动物肺脏结核病变范围。无病变为0；结核病变偶见为±，指数为0.5；病变范围＜全肺10％为＋，指数为1；病变占全肺10％～24％为＋＋，指数为2；病变占全肺25％～50％为＋＋＋，指数为3；病变＞全肺50％为＋＋＋＋，指数为4。(2) 光镜观察：A、B组分别于攻毒后第2、4、6、8周脱颈处死。正常小鼠同期处死，每次解剖6只小鼠。取出肺脏立即放入10％中性甲醛中固定，经脱水、透明、浸蜡、包埋及切片，厚5 μm，分别做HE染色及免疫组织化学染色。

5.免疫组织化学染色方法：切片经预处理后，顺序滴加适当稀释的特异性抗体(IFN-γ、IL-4为1∶300，iNOS为1∶150),4℃过夜，生物素标记的二抗工作液，37℃，30分钟及辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素，37℃，30分钟。DAB-H₂O₂溶液显色（1～10分钟）， 终止显色，苏木精复染，脱水，透明，封片。结果棕黄色为阳性显色。

6. 图像分析：每只小鼠肺标本取3张切片进行3种抗体染色，每张切片随机选取5个视野，用图像分析系统分别测定（40×5视野下）单位面积 IFN-γ、IL-4、iNOS阳性细胞的面积，用面密度表示。

7. 统计学处理：各指标以±s表示，采用方差分析和直线相关分析。

结果

一、小鼠肺组织病理改变

感染组小鼠感染后1个月，肺组织内出现较多泡沫样的M（M吞噬结核分支杆菌后形成）及淋巴细胞形成的炎症区域，并有大量多核白细胞及蛋白渗出物。感染后2月，肺实质内广泛肺炎区伴有灶性坏死和胆固醇结晶（为M吞噬结核分支杆菌后崩解所致，图1），其内有大量结核分支杆菌（抗酸染色所见）。

图1感染后8周小鼠肺组织病变，呈弥漫性病变，可见局灶性坏死和胆固醇结晶HE×100

母牛菌苗免疫攻毒组小鼠感染后1个月，肺部病变局限化，结核性肉芽肿内出现以上皮样细胞为主的增殖性结节及以淋巴细胞为主的淋巴样细胞结节。感染2个月，肺部病灶进一步局限化，结核结节更趋典型，未见灶性坏死(图2)。