T淋巴细胞在哮喘气道炎症的发生和发展中起枢纽作用。哮喘时激活的T淋巴细胞增加^［1］，白细胞介素3（IL-3）、IL-5、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子mRNA（GM-CSF mRNA）表达增强，除了抗原反复刺激外，与T淋巴细胞凋亡障碍，生存时间延长可能也有一定的关系。 目前，已证实凋亡的发生是受基因控制，发现了许多与凋亡有关的基因。我们的实验观察了哮喘豚鼠外周血淋巴细胞的凋亡及其相关基因B细胞淋巴瘤（bcl-2）、白细胞介素1β转化酶（ICE）的表达。

材料与方法哮喘豚鼠模型：雄性豚鼠400～500 g，20只豚鼠随机分为哮喘组和对照组， 每组10只。哮喘组在第1天和第8天分别用2% 卵白蛋白（OA）氯化钠0.5 ml(OA 2 g+0.9%氯化钠100 ml)+氢氧化铝凝胶0.5 ml腹腔注射,第21天密闭溶器中雾化吸入2% OA 1小时,或出现哮喘样发作为止。对照组按哮喘组的用量和方法用0.9% 生理盐水取代OA。

标本留取：分别于激发后48小时处死动物，取颈动脉血肝素抗凝，沿管壁缓慢加入盛有淋巴细胞分离液的试管中，1 500 r/min，离心15分钟，取淋巴细胞层混悬液，PBS漂洗3次共5分钟，制成均匀的细胞涂片，4%多聚甲醛固定30分钟，-70℃保存备用。

凋亡细胞的原位末端法（TUNEL）标记：凋亡试剂盒购自德国宝灵曼公司，标记方法参照说明操作。主要步骤：0.1% 曲通(Triton X-100), 4℃处理2分钟, 以增强细胞的通透性,PBS漂洗3次共5分钟(下同)。加入由末端脱氧核糖核苷酸转移酶（TdT），脱氧三磷酸核苷（dNTP）和荧光素标记的dNTP组成的混合物每片30 μl，37℃孵育60分钟，PBS液漂洗，碱性磷酸酶连接的抗荧光素抗体每片30 μl，37℃孵育30分钟，PBS液漂洗，5-溴-4-氮-3-吲哚-磷酸盐/硝基四唑氮蓝（BCIP/NBT）显色，光镜观察。

即用型链酶合素-生物素-酶复合物(SABC)免疫细胞化学染色：(SABC)试剂盒与bcl-2、ICE单克隆抗体均购自武汉博士德公司（丹麦DAKO产）。染色方法参照说明书，主要步骤：甲醇-H₂O₂封闭内源性过氧化物酶15分钟，PBS液漂洗，0.1% Triton X-100、室温15分钟，20% 小牛血清封闭非特异着色；分别加bcl-2（1∶50）、ICE（1∶50）单克隆抗体每片20 μl，37℃、30分钟，然后4℃过夜，PBS液漂洗；加生物素化的羊抗小鼠IgG，每片30 μl，37℃、30分钟，PBS液漂洗；加即用型SABC试剂，37℃、30分钟；3，3-二氨基联苯胺四酸盐(DAB)显色，部分苏木素复染，光镜观察。

结果观察：TUNEL染色和bcl-2、ICE免疫细胞化学染色，每例涂片在高倍（×400）镜下随机选择10个视野，计算凋亡阳性细胞的平均百分率和免疫细胞化学染色阳性率。

统计学处理：百分率以±s表示，采用非配对资料t检验和相关分析，P＜0.05为相异有显著性。

结果染色结果：凋亡细胞呈棕褐色，正常淋巴细胞着色很浅，高倍镜下染色主要在核膜（图1，2）。bcl-2阳性信号呈棕黄色，定位于胞浆、核膜（图3，4），ICE阳性信号定位于胞浆和细胞核（图5，6）。

淋巴细胞凋亡率：哮喘组为(3.5±1.0)% ，对照组为（6.8±1.5）% ，哮喘组显著低于对照组（P＜0.01）。

bcl-2、ICE基因蛋白表达：bcl-2哮喘组显著高于对照组（P＜0.05）;ICE表达哮喘组低于对照组(P＜0.05)。

讨论细胞凋亡是生物体内存在的一种普遍现象，对维持组织细胞的平衡起着重要的作用。研究表明，哮喘发作时患者外周血T淋巴细胞处于活化状态，其活化程度除了与活化产物水平及病情转归有密切相关外，与淋巴细胞凋亡障碍，生存时间延长可能也有一定关系^［1］。Zhang等^［2］比较了小鼠T辅助淋巴细胞Th₁和Th₂亚群受到抗原刺激后凋亡的变化，当Th₁和Th₂共同培养时，Th₂存活时间长于Th₁。由此推测，支气管哮喘时Th₂的存活时间也可能延长，从而分泌更多细胞因子。本组实验结果表明，哮喘豚鼠外周血淋巴细胞凋亡率明显低于对照组，提示哮喘时外周血淋巴细胞凋亡降低，与以上结果一致。Bcl-2是一种凋亡抑制基因，与多种细胞的凋亡抑制密切相关^［3］。Vanx等^［4］报告了bcl-2基因可以阻止淋巴细胞和神经细胞凋亡。近年来发现，ICE在细胞死亡通路处于重要位置，细胞外的死亡信息与细胞表面Fas结合，传入细胞内，ICE被认为是细胞凋亡的执行者，它的激活使细胞内蛋白水解，导致DNA片段产生，细胞发生凋亡^［5］，关于ICE在哮喘方面的研究较少。本组结果表明，哮喘豚鼠外周血淋巴细胞存在凋亡抑制， 而其凋亡相关基因bcl-2表达增高、ICE表达降低，可能在哮喘淋巴细胞凋亡中起重要作用。

图1哮喘组外周血淋巴细胞凋亡，原位末端标记法BCIP/NBT显色×200图2对照组外

周血淋巴细胞凋亡，原位末端标记法BCIP/NBT显色×200图3哮喘组外周血淋巴细胞bcl-2

表达，免疫组化检测对氨基联苯胺显色×400图4对照组外周血淋巴细胞bcl-2表达，免

疫组化检测对氨基联苯胺显色×200图5哮喘组外周血淋巴细胞白细胞介素1 β转化酶

表达，免疫组化检测对氨基联苯胺显色×200图6对照组外周血淋巴细胞白细胞介素1

β转化酶表达免疫组化检测对氨基联苯胺显色×200

(本文图1～6见插页第44页)

参考文献

1Corrigan CJ, Kay AB.CD₄ T-lymphocyte activation in acute severe asthma. Am Rve Respir Dis，1990，141:970.

2Zhang X,Bvuner T,Carter L,et al. Unreal death in thelper cell (Th₁) and Th₂ effectors.Th₁ but not Th₂ effectorsundergo fas/fas l-mediated apoptosis. J EXP Med , 1997, 185: 1837.

3Woolley KL, Gibson PG, Carty K, et al. Eosinophil apoptosis and the resolution of airway inflammation in asthma.Am J Respir Crit Care Med,1996，154:337.

4VauxD．Bcl-2 initiates a new categorg of oncogenes: regulators of cell death. Nature,1988,335:440.

5Barinaga M. Forging a path to cell death. Science，1996,273:735.

收稿:1999-04-09修回:1999-07-28