关键词： 嗜酸细胞；淋巴细胞；气道高反应性；哮喘

【摘要】目的探讨CD86分子对抗原引起气道炎症和气道高反应性的影响，加深认识CD86在支气管哮喘发病机制中的作用。方法应用鸡卵清蛋白致敏和刺激BALB/c小鼠(每组8只)以诱导嗜酸细胞（EOS）聚集到气道，收集支气管肺泡灌洗液（BALF）细胞并以流式细胞仪检测CD86分子的表达水平；观察静脉注射抗CD86单克隆抗体后BALF中EOS数和气道反应性的变化。结果小鼠经抗原致敏和刺激后BALF中可以见到大量的EOS，气道反应性亦明显升高，BALF细胞所表达的CD86水平也随之增高。经抗CD86单克隆抗体处理后，BALF中EOS数降低了67%（P＜0.01）；同时，气道反应性也下降69%（P＜0.01）。此外，抗CD86单克隆抗体还可以抑制肺组织局部白细胞介素4和白细胞介素5的产生。结论抗CD86单克隆抗体能够抑制气道EOS浸润和降低气道反应性，其作用机制可能是通过抑制局部白细胞介素4和白细胞介素5产生而实现。提示抑制气道抗原呈递细胞的活性应有益于哮喘的治疗。

A study on the roles of CD86 in antigen-induced eosinophil infiltration into airways and airway hyperresponsiveness

SHI huanzhong, QIN Shouming, XIAO Changqing, et al .

department of Respiratory Medicine, First Affiliated Hospital, Guangxi Medical university, Nanning 530021

【Abstract】ObjectiveTo explore the effect of CD86 on antigen-induced eosinophil infiltration into the airways and airway hyperresponsiveness in sensitized mice, and further elucidate the role of CD86 in the pathogenesis of bronchial asthma. MethodsFemale bALB/c mice (n=8 for each group) were sensitized and challenged with ovalbumin to induce airway eosinophilia and airway hyperresponsiveness . Airway responsiveness was espressed by the provocative concentration of acetylcholine causing 50% increase in respiratory resistance (PC₅₀).Effect of anti-CD86 monoclonal antibody (mAb) on antigen-induced changes of eosinophil numbers in brochoalveolar lavage fluid (BALF) and airway reactivity was observed. CD86 expression on BALF cells was detected by flow cytometry and concentrations of interleukin-4 and interleukin-5 in homogenized supernatant of lung tissue were determined by ELISA. ResultsIn sensitized mice challenged with ovalbumin 20 minutes once a day for 6 days , the number of BALF eosinophils was (9.2±l.5)×10⁸/L. However, no eosinophil could be found in the BALF from mice without ovalbumin sensitization and challenge. Also, ovalbumin treatment led to PC₅₀ value decrease from (0.66±0.13) g/L to (0.17±0.07) g/L (P＜0.01). CD86 expression on BALF cells from ovalbumin sensitized- and challenged-mice (36.4±6.2) was much higher than that from control mice (12.3±3.6, P＜0.01). In mice treated with intravenous injection of anti-CD86 mAb before each challenge, BALF eosinophils decreased by 67% (P＜0.01 ), and PC₅₀ value increased by 69%(P＜0.01). Our results showed that anti-CD86 mAb prevented antigen-induced airway eosinophilia and airway hyperresponsiveness accompanied by a decrement of levels of both interleukin-4 and interleukin-5 in lung tissue. ConclusionsAnti-CD86 mAb is able to inhibit antigen-induced airway eosinophilia and to ameliorate airway hyperresponsiveness, possibly by inhibiting production of interleukin-4 and interleukin-5. These data suggested that the blockade of airway antigen-presenting cells′ funct ions couid be of value in treatment of human asthma.

【Key words】Eosinophil lymphocyte Airway hyperresponsiveness Asthma

支气管哮喘最主要的病理特征是T淋巴细胞和嗜酸细胞(EOS)浸润到气道粘膜组织，此两种细胞于激活后都能释放多种炎症介质参与哮喘的发病过程。T细胞的激活需要两类性质不同的信号。第一信号来自T细胞受体和抗原呈递细胞(APC)，表面Ⅱ类主要组织相容性复合体分子于抗原存在时相互作用的复合体；第二信号为T细胞表面的CD28分子和APC表面B7分子(包括B 7-1即CD80和B 7-2即CD86)相互作用后传递给T细胞的所谓共刺激信号。体外实验结果表明，应用单克隆抗体(单抗)封闭CD80和CD86分子以阻断CD28／B7通路之后，作为APC的EOS将抗原呈递给T细胞从而促使后者增殖的能力随即被抑制^［1］。这些资料提示CD80和CD86在T细胞激活过程中具有十分重要的作用。 harris等^［2］曾经报道去除CD80分子的作用可以阻止T细胞和EOS浸润到致敏小鼠的呼吸道。我们的研究应用流式细胞仪检测鸡卵清蛋白(OVA)致敏小鼠经OVA雾化吸人刺激后，支气管肺泡灌洗液(BALF)细胞表达CD86分子的水平，并观察抗CD86单抗对抗原引起的气道炎症和气道高反应性的影响。

材料与方法

一、抗原致敏和刺激

按照我们以前所报道的方法^［3］，给5周龄的雌性BALB/c小鼠腹腔注射10μg OVA和20 mg氢氧化铝（均购自美国Sigma公司），2周后重复同样剂量的OVA和氢氧化铝再注射1次，于第2次注射2周后将小鼠置于一个塑料盒中给予5% oVA［溶于磷酸盐缓冲溶液（PBS）］雾化吸入刺激，每天1次，每次20分钟，共6天。雾化动力由5L/min的压缩空气提供。

二、实验设计和抗CD86单抗用药

本组研究分3套处理过程完全相同的实验进行：第l套用于收集BALF计数EOS和检测BALF细胞CD86的表达；第2套用于测定气道反应性；第3套用于测定肺组织中白细胞介素(IL)4和IL-5的含量。每套实验均将32只小鼠随机分为4组，每组8只。 a组为阴性对照组，以PBS液代替OVA作腹腔注射0.2 ml和雾化吸入； b组为阳性对照组，给予OVA致敏和刺激，但不给抗CD86单抗用药；C组和D组分别为CD86处理组和IgG对照组，均给予OVA致敏和刺激，每天于OVA刺激前30分钟分别经尾静脉注射100μg抗CD86单抗或大鼠同类IgG_2a(均购自美国Pharmingen公司)。

三、BALF的收集和处理

于最后1次刺激24小时后注射过量苯巴比妥钠将小鼠处死后用一小导管连接暴露的气管，以5 ml PBS液分6次灌洗支气管肺泡收集BALF，回收率均＞90％。计数BALF中的细胞总数，离心后将部分BALF细胞涂片染色后进行细胞分类，最后计算出EOS实际数。

四、CD86分子表达的检测

将5×10⁵个BALF细胞以PBS液洗涤2次，悬于100 μl含有牛血清白蛋白(1 g/L)和叠氮钠(0.1 g/L)的PBS液中，分别与5 μl(0.5 g/L)荧光素标记的抗CD86单抗或同类IgG_2a(均购自美国Pharmingen公司)于4℃孵化30分钟后，以同样的PBS液洗涤2次，再以0.5％多聚甲醛固定。24小时内以FACStar plus流式细胞仪以及Cellquest软件(均为美国Becton Dickinson公司)分析BALF细胞所表达的CD86分子水平，结果以平均荧光密度表示。

五、气道反应性测定

于最后1次刺激24小时后，给小鼠腹腔注射苯巴比妥钠(5 mg/kg)使其麻醉，将小鼠置于一个体积描记盒中以小导管将气管和1683型啮齿动物呼吸机(美国Harvard apparatus产品)相连接，并以频率为120次/分，潮气量为0.4 ml行机械通气。肌肉注射氯化筒箭毒碱(3.3 mg/kg)阻断小鼠自主呼吸后连续记录呼吸阻力。给小鼠由低浓度至高浓度(0.08～1.25 g/L)雾化吸入乙酰胆碱溶液(溶于PBS液中)，每一浓度吸入2分钟，间隔5分钟，直至气道阻力增加达到或超过50％以上，最后计算引起气道阻力增加50％时所吸入乙酰胆碱的浓度(PC₅₀)，以此表示气道反应性。

六、肺组织中细胞因子含量的测定

于最后1次刺激24小时后暴露小鼠胸腔，以含乙二胺四乙酸(EDTA，2 mmol/L)的PBS液冲洗肺血管床后切出肺脏，称取肺组织重量后将其置于含有EDTA(0.1 mmol/L)，硫酰氟化苯甲醇(0.1 mmol/L)，抑肽素(1 μmol/L)，蛋白酶抑制剂1eupeptin(2μmol/L)的PBS液中以组织裂解器(美国Branson Sonic Power公司)将其制成组织匀浆，于4℃，14000 r/min，离心l小时，收集上清液冻存于-80℃待测其中IL-4和IL-5含量。IL-4和IL-5含量的测定采用酶联免疫吸附试验(ELISA)。所用ELISA试剂盒均购自美国Endogen公司，并按产品所附说明书进行操作。最终结果以pg/g肺组织表示。

七、统计学分析

所有数据以±s表示，各组结果比较采用t检验，方差分析和q检验。

结果

一、CD86在BALF细胞的表达

我们应用流式细胞仪检测作为阴性对照的A组和作为阳性对照的B组小鼠BALF细胞表面表达CD