关键词： 降钙素基因相关肽；肺疾病，阻塞性；哮喘

【摘要】目的探讨慢性阻塞性肺疾病(COPD)和支气管哮喘患者气道分泌物中，感觉神经肽降钙素基因相关肽(CGRP)释放在气道慢性炎症性疾病发病中的作用。方法选择稳定期COPD患者19例、支气管哮喘患者14例、正常对照组10名，通过面罩吸入超声雾化的4%高张盐水诱导痰液，将获得的诱导痰涂片进行瑞氏-姬姆萨染色计数细胞成分的变化，用放射免疫方法测定诱导痰中CGRP免疫反应性物质(CGRP-LI)的含量改变，并进行CGRP-LI与一秒钟用力呼气容积(FEV₁)的相关性分析。结果诱导痰中CGRP-LI含量在COPD组为(15.97±2.15)ng/L，支气管哮喘组为(18.79±3.91)ng/L，与正常对照组(2.36±0.35)ng/L比较，差异有显著性(P＜0.05)，而且与FEV₁呈显著负相关(r=-0.50和-0.61, P均＜0.05)。COPD患者诱导痰中中性粒细胞百分比为(64.9±2.9)%,与支气管哮喘患者(26.5±1.5)%和正常对照组(25.9±2.6)%比较，差异有显著性(P＜0.01)；支气管哮喘患者诱导痰中嗜酸细胞百分比为(5.80±0.50)%，与COPD患者(1.00±0.20)%和正常对照组(0.80±0.10)%比较，差异有显著性(P＜0.01)。结论CGRP释放增多可能参与气道慢性炎症的发病。

Changes of calcitonin gene-related peptide content in induced sputum from patients with COPD and asthma

XU Hui, ZHAO Mingwu, WANG Xian.

Third Hospital of Beijing Medical University, Beijing 100083

【Abstract】ObjectiveTo explore the role of sensory neuropeptide calcitonin gene-related peptide (CGRP) in the pathogenesis of chronic airway inflammatory diseases COPD and bronchial asthma. MethodsPatients with COPD (n=19), bronchial asthma (n=14), all were in stable stage and 10 normal volunteers were examined. After hypertonic saline inhalation challenge in all subjects, CGRP-LI concentration in the induced sputum was measured by radioimmunoassay. Cellular content was assayed by microscopic analysis, the relation between CGRP-LI level and FEV₁ value was calculated by liner regression. ResultsThe sputum CGRP concentrations in patients with COPD and patients with asthma were (15.97±2.15)ng/L, (18.79±3.91)ng/L, respectively, both were significantly higher than those in normal volunteers (2.36±0.35)ng/L. Moreover, CGRP concentrations in induced sputum in each disease group were correlated with the degree of airflow obstruction, r=-0.50 and -0.61, respectively （P＜0.05）. The percentage of neutrophil cell count (64.9±2.9)% was significantly higher in patients with COPD （P＜0.01）, while the percentage of eosinophil cell count (5.8±0.5)% was increased in patients with asthma （P＜0.01）. ConclusionsThe data suggested that CGRP release may participate in the chronic inflammation of patients with COPD and bronchial asthma.

【Key words】Calcitonin gene-related peptidePulmonary disease, obstructiveAsthma

慢性阻塞性肺疾病(COPD)和支气管哮喘是两种气道慢性炎症性疾病，它们在病理、细胞学以及临床特征等方面有许多相似之处。炎性介质和神经介质的大量释放在COPD和哮喘发病过程中可能具有重要作用^［1］。降钙素基因相关肽(CGRP)是一种感觉神经来源的神经肽，具有广泛的生物学效应。在呼吸系统中，CGRP与速激肽(TKs)共存于感觉神经末梢，并可通过无髓鞘的C纤维介导的轴突反射共同释放出来，增加气道粘膜血流，改变气道口径，加强P物质(SP)引起的血管通透性增加和血浆蛋白渗出，以上这些病理变化在慢性支气管炎等气道炎症反应中均可见到^［2］。根据上述CGRP的作用以及它参与感染中毒性休克等其它类型炎症性疾病的特点^［3］,我们推测CGRP可能在COPD和支气管哮喘的发病中也具有重要作用。

我们以往动物实验的工作表明，CGRP参与大鼠慢性支气管炎的病理生理过程。文献报道主要集中在研究支气管哮喘时CGRP的作用^［1］，多数结果显示，CGRP在支气管哮喘中具有重要的意义，而CGRP在COPD中的作用还鲜有报道。

我们对COPD和支气管哮喘患者进行诱导痰中CGRP免疫反应性物质(CGRP-LI)测定，研究在上述疾病状态下CGRP-LI释放的改变以及与病情严重程度的关系，以探讨CGRP在COPD和支气管哮喘发病中的作用。

对象与方法

一、研究对象

COPD组19例, 男14例，女5例，年龄49～75岁，平均年龄66±7岁，其中吸烟者11例，不吸烟者8例；支气管哮喘组14例, 男6例，女8例，年龄21～70岁，平均年龄42±16岁，其中吸烟者4例，不吸烟者10例；正常对照组10名, 男6名，女4名，年龄25～75岁，平均年龄52±15岁，其中吸烟者和不吸烟者各5名。所有病例均符合中华医学会呼吸病学分会制定的COPD和支气管哮喘诊断标准^［4，5］。所有患者均处于稳定期。各组的一秒钟用力呼气容积占预计值百分比（FEV₁占预计值%）的平均值分别为：COPD组(53±4)％、支气管哮喘组(64±5)％、正常对照组(96±5)％。

二、实验方法

1. 痰液采集：参照Pin等^［6］报道的方法并加以改进：受试者于试验前24小时停用所有支气管扩张剂，于试验前12小时禁用含咖啡因的食物和饮料。试验前15分钟吸入沙丁胺醇200 μg(英国葛兰素公司)，以预防吸入高张盐水可能引起的支气管痉挛。面罩吸入超声雾化(超声雾化治疗仪，北京亚都加湿器公司)的4％高张盐水15～30分钟直至痰量达到约1 ml。为防止混入唾液，采用肉眼和倒置显微镜观察的方法去除唾液。痰液经振荡混匀后取10 μl加入等量0.1%二硫代苏糖醇(DTT，美国Sigma公司)混匀，先进行细胞计数，然后涂片行瑞氏-姬姆萨染色，计数200个非上皮细胞进行细胞分类。向剩余的痰液中加入2倍体积的0.1%三氟乙酸(美国Sigma公司)溶液，用超声波粉碎机(JY350型，浙江三门超声波仪器厂)粉碎，以3 000 r/min离心20分钟，取上清过C18柱(美国半岛公司)，经冷冻离心机干燥后，冷冻于-40℃以待放射免疫测定，测定结果以每升痰液中CGRP-LI的量表示(ng/L)。

2. CGRP的放射免疫测定：采用我们以前报道的特异性放射免疫分析法^［3］，放射免疫缓冲液为0.1%牛血清白蛋白(BSA), 0.01%叠氮钠(NaN₃), 5 mmol/L NaCl, 0.1% TritonX-100的0.1 mmol/L的磷酸缓冲液(pH 7.4)。将大鼠CGRP标准品、样本与CGRP抗体在4℃孵育24小时，加入¹²⁵碘-降钙素基因相关肽(¹²⁵I-CGRP, 74 Bq/mol，中国科学院高能物理所)，再孵育24小时，加入羊抗兔IgG和正常兔血清，室温下反应120分钟，以分离游离和结合的同位素标记CGRP，最后每管放入0.5 ml缓冲液，在4℃ 3 000 r/min离心20分钟，弃除上清，用γ计数器(1470型，瑞士WALLAC公司)测定沉淀中的¹²⁵I放射性强度，再根据标准曲线计算出样本中CGRP的含量(大鼠CGRP、CGRP抗体、羊抗兔IgG、正常兔血清购自美国半岛公司，BSA、NaN₃、TritonX-100购自美国Sigma公司)。

三、统计学处理

实验结果均以±s来表示，进行多组结果比较时采用单因素方差分析，组间两两比较用Student-Neuman-Keuls检验，比较两组间结果时采用组间均数t检验，进行相关性研究采用线性回归分析，以P＜0.05为差异有显著性。

结果

一、三组患者的平均痰量

COPD组(1.5±0.3) ml、支气管哮喘组(1.3±0.4) ml及正常对照组(1.1±0.1) ml三组间比较差异无显著性(P＞0.05)。所有受试者痰中鳞状细胞数量均＜10％，说明样本来自下呼吸道。

二、各组诱导痰中CGRP-LI的水平

COPD组(15.97±2.15) ng/L、支气管哮喘组(18.79±3.91) ng/L与正常对照组(2.36±0.35) ng/L比较，差异有显著性(P＜0.05)，而在两疾病组间比较差异无显著性(P＞0.05，图1)。

三、疾病组诱导痰中CGRP-LI与FEV₁的关系

COPD患者诱导痰中CGRP-LI与他们的FEV₁占预计值%呈显著负相关(r=-0.50, P＜0.05)。在支气管哮喘患者相关性分析也得到了类似结果(r=-0.61, P＜0.05，图2)。

图1高张盐水诱导痰中CGRP-LI水平的变化

图2COPD组和支气管哮喘组高张盐水诱导痰中CGRP-LI水平

与FEV₁占预计值%的相关性<