关键词： 哮喘；嗜酸细胞凋亡；激素抵抗

【摘要】目的观察激素抵抗型（SR）哮喘是否存在嗜酸细胞（EOS）凋亡功能的异常及促炎症细胞因子白细胞介素5（IL-5）和粒-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的调节作用。方法分离SR（15例）、激素敏感型（SS，30例）两组哮喘患者外周血单个核细胞（PBMCs）及EOS，体外培养后测定：（1）PBMCs在糖皮质激素处理前、后分泌细胞因子的能力；（2）自发的或糖皮质激素诱导的或用PBMCs培养上液处理后的EOS凋亡率及Fas抗原表达率。结果（1） 糖皮质激素处理前SS组与SR组患者PBMCs分泌IL-5水平（μg/L）分别为196±68、235±98；GM-CSF分泌水平（μg/L）SS组和SR组患者分别为325±110、356±131，两组比较差异均无显著性（P＞0.05）。地塞米松处理后与处理前比较，SR组IL-5水平为（210±75）μg/L，差异有显著性（P＜0.01）；GM-CSF为（312±147）μg/L，差异有显著性（P＞0.01）；SS组IL-5为（147±62） μg/L，差异有显著性（P＜0.01），GM-CSF为（270±97）μg/L，差异有显著性（P＜0.05）。（2）SS组与SR组EOS在体外培养时均发生不同程度的凋亡。EOS基础凋亡率SS组为（67±21）%，SR组为（33±17）%，两组与诱导前比较差异有显著性（P＜0.001）。Fas抗原表达率SS组为（54±23）%，SR组为（27±15）%，两组比较差异有显著性（P＜0.001）。地塞米松诱导后，SS组凋亡率为（89±20）%，与诱导前比较差异有显著性（P＜0.01），Fas表达率为（60±17）%，与诱导前比较差异无显著性（P＞0.1）。SR组EOS诱导凋亡率和Fas表达率分别为（41±18）%、（35±13）%，与诱导前比较差异无显著性（P均＞0.1）。同一患者的PBMCs培养上液可对抗地塞米松诱导EOS凋亡的作用，以SR组更为明显。结论SR患者的EOS存在自身凋亡功能的缺陷并对激素诱导凋亡作用不敏感，同时Th2细胞分泌促炎症细胞因子的活性不能为激素所抑制，是EOS凋亡不足的另一原因。

Effect of eosinophil apoptosis on glucocorticoid-resistant asthma

LIU Chuntao, WANG Zengli, XIE Min, et al.

(Division of Respiratory Medicine, The First Hospital of West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041, China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the function of eosinophil apoptosis and regulation of glucocortico steroids on IL-5 and GM-CSF expression in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) in glucocorticoid-resistant asthmatic patients. MethodsEosinophils (EOS) and PBMCs isolated from glucocorticoid-sensitive (SS, 15 cases) and resistant (SR, 30 cases) asthmatic subjects were cultured and treated with dexamethasone (DXM) in vitro. Concentrations of IL-5 and GM-CSF were determined by ELISA in the supernatants recovered in sham and DXM treated cells. The rates of EOS apoptosis and Fas antigen expression were documented via flow cytometer in sham, DXM treated and PBMC supernatant treated groups respectively. ResultsThere were no statistical significant differences of the concentrations of both IL-5 and GM-CSF in sham cultured PBMC supernatants between SS and SR groups ［(196±68) μg/L vs. (235±98 ) μg/L IL-5 (P＞0.05), (325±110) μg/L vs. (356±131) μg/L GM-CSF (P＞0.05); SS versus SR groups, respectively］. There were statistically significant decreases in both IL-5 and GM-CSF after DXM exposure in SS group ［(196±68) μg/L vs. (147±62) μg/L IL-5 (P＜0.01); (325±110) μg/L vs.(270±97) μg/L GM-CSF (P＜0.01)］. In contrast, there were no significant differences in both IL-5 and GM-CSF after DXM exposure in SR group. Baseline rates of both EOS apoptosis and Fas antigen expression were statistically significant different between SS and SR groups ［(67±21)% vs. (33±17)% the rate of EOS apoptosis (P＜0.001); (54±23)% vs.(27±15)% the rate of Fas antigen expression (P＜0.001), SS versus SR groups, respectively］. A dramatic increase in EOS apoptosis after DXM exposure was observed in SS group ［(67±21)% vs. (89±20)% (P＜0.01), baseline vs. DXM exposure, respectively］, but there was no significant change in Fas antigen expression. There were no significant changes in both EOS apoptosis and Fas antigen expression in SR group after DXM exposure. ConclusionsThese data suggest that EOS compromised apoptosis might exist and could not be affected by glucocorticoid induction in SR asthma. On the other hand, Th2 cytokine over-expression could not be inhibited by glucocorticoid in SR group in vitro.

【Key words】Asthma;Eosinophil apoptosis;Glucocorticoid resistant

依据对糖皮质激素（GC）治疗的反应性，哮喘患者可分为激素敏感型（SS）、激素依赖型（SD）与激素抵抗型（SR）。激素抵抗型患者一般病程较长，气道高反应性较严重，即使给予大剂量的糖皮质激素治疗，疗效亦不理想，临床处理较为棘手。近年来对于哮喘激素抵抗的机制进行了广泛的研究，发现此类患者T细胞及嗜酸细胞（EOS）表面GC受体的亲和力下降，单核细胞表面补体受体表达缺陷，局部存在高浓度的炎性转录因子如激活肽1（AP-1）、转录因子κB（NF-κB）等^［1］。EOS作为哮喘气道炎症的主要效应细胞，其凋亡与抗凋亡机制近年倍受重视，一般认为EOS凋亡是气道炎症消退的重要途径之一，而哮喘时存在EOS凋亡不足。但EOS凋亡与激素抵抗的关系，迄今的研究甚少涉及。我们通过对一组SS和SR哮喘患者EOS凋亡现象及其调控机制的比较研究，试图了解：（1）哮喘的激素抵抗是否与EOS凋亡功能低下有关；（2）激素抵抗时促炎症细胞因子白细胞介素5（IL-5）、粒-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的表达水平及其对EOS凋亡的调控作用。

对象与方法

一、对象

哮喘患者45例，均符合中华医学会呼吸病学分会哮喘学组制订的诊断标准^［2］。所有患者基础一秒钟用力呼气容积占预计值百分比（FEV₁占预计值％）≤75％，支气管舒张试验阳性（FEV₁占预计值％改善≥15％）。受试者无严重心、肝、肾疾患及恶性肿瘤，受试前1个月未使用免疫调节剂或细胞毒药物。其中SS 30例，SR 15例，标准：口服泼尼松20 mg/d 1周，FEV₁占预计值％改善≥25％为激素敏感型，≤15％为激素抵抗型。

二、设备和试剂

紫外分光光度仪（U-3400，日本日立公司）、751 GW型分光光度仪、酶标仪、流式细胞检测仪（Coulter Elitee ESP，法国）。人IL-5酶联免疫(ELISA)试剂盒，人GM-CSFELISA试剂盒（ENDOGEN，美国）、FITC标记抗CD₉₅，碘化丙啶（PI）染液（美国Sigma公司，工作液50 μg/ml），细胞固定-打孔试剂盒（IntraPrep^TM Permeabilization Reagent，法国Coulter公司）。

三、方法

1.外周血单个核细胞（PBMC）与嗜酸细胞的分离和制备：停用泼尼松2周以后，采取外周静脉血20 ml，肝素抗凝，等体积Hank液稀释、混匀，用淋巴细胞分离液（深圳华美公司分装）分离获取PBMC，用Hank液洗涤2次，调整细胞浓度为1×10⁶/ml。取管底颗粒细胞重悬于相对密度为1.070含10％小牛血清的percoll液。制备4个不同密度的percoll液，密度分别为1.08 kg/L、1.09 kg/L、1.095 kg/L、1.10 kg/L，依次加入10 ml离心管铺成不连续密度梯度。将上述细胞悬液取2 ml加入离心管中，4 ℃、3 000 r/min离心20 min后，吸取1.095～1.10 kg/L界面的细胞^［3］涂片，Wright-Giemsa染色证实EOS＞90%，台盼蓝拒染法细胞活力＞95％。细胞浓度调整为1×10⁵/ml。

2.PBMC体外培养及细胞因子检测：PBMC以无血清RPMI 1640培养液洗涤，制成细胞悬液，置96孔培养板，每份2孔，每孔细胞数1×10⁵ ml，加入植物血凝素（PHA）终浓度为50 mg/L，其中1孔加入地塞米松（DXM，美国Sigma公司），终浓度为10^-6mol/L，孵育24 h（37 ℃，5％ CO₂），吸取上液，以IL-5、GM-CSF ELISA试剂盒测定IL-5和GM-CSF浓度。

3.EOS体外培养：EOS以无血清RPMI 1640液洗涤。制成细胞悬液，加入96孔培养板中，细胞浓度为每孔10⁴ ml，每一受试者分为3孔，其中2孔分别加入：（1）DXM，终浓度为10^-6mol/L；（2）DXM（10^-6mol/L）+同一受试者PBMC培养上液10 μl。体外孵育72 h（条件同上）。

4.EOS凋亡率与Fas抗原检测：取70 μ孔径尼龙筛网过滤孵育EOS，滤过液低速离心1 000 r/min，3 min，去上清；调整细胞浓度为10⁴/ml，加入CD₉₅-FITC10U，按操作程序在室温避光孵育15 min后，加入5 ml PBS缓冲液离心洗涤，去上清。细胞固定打孔；经以上步骤处理的细胞转入流式上机试管，加入1 ml PI工作液作DNA染色，15 min后上机检测；由流式细胞仪专用数据分析软件（Elitee）进行数据处理。凋亡细胞与CD₉₅（Fas）阳性细胞分别以占总<