关键词： 白三烯受体拮抗剂；气道上皮细胞；气道平滑肌细胞；内皮素

【摘要】目的探讨半胱氨酰白三烯(CysLTs)受体拮抗剂(扎鲁司特)对白三烯C₄(LTC₄)刺激人气道结构细胞内皮素1(ET-1)基因表达及分泌的影响。方法在离体培养人气道上皮细胞株(16-HBE)和气道平滑肌细胞(ASMC)培养液中加入扎鲁司特，采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测培养液ET-1水平；用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)方法检测ET-1 mRNA表达量。结果扎鲁司特可抑制LTC₄ 诱导16-HBE及ASMC ET-1 mRNA表达及ET-1释放。16-HBE ET-1 mRNA由0.23±0.10降至0.10±0.03，ET-1由(12.7±1.3) ng/L降至(5.5±2.6) ng/L，前、后比较差异有显著性(t分别为3.698和4.693，P分别为0.034和0.019)；ASMC ET-1 mRNA由 0.13±0.04 降至0.04±0.02；ET-1由(7.5±1.0) ng/L降至(4.4±0.9) ng/L，前、后比较差异有显著性(t分别为4.629和5.003，P分别为0.019和0.007)。结论扎鲁司特能抑制LTC₄诱导16-HBE及ASMC ET-1 mRNA表达及ET-1释放，这可能是CysLTs受体拮抗剂抗气道炎症的机制之一。

Zafirlukast inhibition of leukotriene C₄ induced endothelin-1 expression in human airway structural Cell

CHEN Aihuan, ZHONG Nanshan.

(Guangzhou Institute of Respiratory Disease，Guangzhou 510120, China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of a cysteinyl leukotriene receptor antagonist (zafirlukast) on endothelin-1(ET-1) expression in human airway epithelial cell line (16-HBE) and airway smooth muscle cells (ASMC) in response to leukotriene C₄ (LTC₄) stimulation. Methods16-HBE or ASMC was incubated with 10^-8 mol/L LTC₄ and graded concentrations of zafirlukast. ET-1 level in supernatant was determined by ELISA and ET-1 mRNA expression was assessed by RT-PCR. Results(1) LTC₄ induced ET-1 mRNA expression in 16-HBE and ASMC was significantly inhibited by zafirlukast (10^-8 mol/L ) 0.23±0.10 vs. 0.10±0.03 (16-HBE), t=3.698, P=0.034; 0.13±0.04 vs. 0.04±0.02 ASMC, t=4.629, P=0.019. (2) When graded concentrations of zafirlukast (0, 10^-12 mol/L, 10^-10 mol/L, 10^-8 mol/L, 10^-6 mol/L ) were added to the LTC₄ cultured 16-HBE and ASMC, a significant inhibition of ET-1 production was observed in both groups cultured with 10^-8 mol/L or more zafirlukast ［(12.7±1.3) ng/L vs (5.5±2.6) ng/L 16-HBE, t=4.693, P=0.019；(7.5±1.0) ng/L vs (4.4±0.9) ng/L ASMC (t=5.003, P=0.007)］. (3) There was a significant negative linear correlation between ET-1 levels and zafirlukast concentrations in LTC₄-treated 16-HBE and ASMC (16-HBE: r=-0.9177, P=0.0289; ASMC: r=-0.9451, P=0.0153）. ConclusionsThese data suggest that zafirlukast inhibis LTC₄- induced ET-1 over-expression 16-HBE and ASMC, which may be one of the anti-inflammatory mechanism of LTs receptor antagonists.

【Key word】Leukotriene receptor antagonist；Airway epithelial cell；Airway smooth muscle cell；Endothelin

半胱氨酰白三烯( CysLTs)受体拮抗剂是近年来发展起来的新一代非类固醇类抗哮喘药。研究证明，CysLTs受体拮抗剂具有抗气道炎症作用^［1］，但有关其抗气道炎症的机制尚未明了。近年发现，气道结构细胞自分泌的内皮素1(ET-1)是气道收缩、炎症与重建的重要介质^［2］，已知参与哮喘发病过程的众多细胞因子是通过形成相互作用的网络而发挥效应的，Patrigani等^［3］报道CysLTs 能促进血管平滑肌细胞释放ET-1。因此有理由推测CysLTs是否亦能促进气道结构细胞释放ET-1，而CysLTs受体拮抗剂可能对抗CysLTs 的此种效应，从而产生抗气道炎症作用，我们的研究通过观察 CysLTs受体拮抗剂(扎鲁司特)对白三烯C₄(LTC₄)刺激人气道上皮细胞和平滑肌细胞 ET-1基因表达及分泌的影响，探讨CysLTs受体拮抗剂抗气道炎症的机制。

材料与方法

一、材料

1.正常人气道上皮细胞株(16-HBE)由英国Southampton大学惠赠。

2.扎鲁司特(zafirlukast)由英国Zeneca公司惠赠。

3.MEM培养液：含10%胎牛血清，200 U/ml 青霉素，200 U/ml 链霉素。

4.F12培养液：含10%胎牛血清，200 U/ml 青霉素，200 U/ml链霉素。

5.平滑肌细胞消化液：含640 U/ml 胶原酶Ⅲ，1 mg/ml豆胰蛋白酶，10 U/ml弹性蛋白酶， 0.2 mmol/L氯化钙。

二、方法

1.LTC₄对人气道结构细胞ET-1 mRNA表达及ET-1分泌水平的作用： 取第3～5代16-HBE细胞，以每孔1×10⁵ ml接种于6孔培养板中培养，当细胞长满85%～90% 瓶底时用于实验。实验共分5组，每组4孔。对照组（ELT 0组）：只加MEM空白培养液及ELT 1～4组，分别加入10^-12 mol/L、10^-10 mol/L、10^-8moL/l、10^-6 mol/L LTC₄后继续培养24 h，收集细胞培养液，密封保存于-80 ℃低温冰箱中待测ET-1。收集 ELT 0组及ELT 3组(预试验证明该浓度刺激ET-1分泌作用最强)细胞提取总RNA，待进行逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)。 取肺移植供体支气管肺组织，参照文献［4］的方法，用3 ml平滑肌消化液室温下消化分离气道平滑肌细胞(ASMC)，用F12培养液培养，待细胞长至基本融合状态后用0.25% 胰蛋白酶消化传代。取第3～5代ASMC，以每孔1×10⁵ ml接种于6孔培养板中继续培养至细胞长满85%～90% 瓶底时用于实验。实验共分5组，每组4孔。对照组（SLT 0组）：只加 F12空白培养液及SLT 1～4组， 各组分别加入10^-12 mol/L、10^-10 mol/L、10^-8 mol/L、10^-6 mol/L LTC₄后继续培养24 h，收集细胞培养液待测ET-1。收集SLT 0组及SLT 3组细胞提取总RNA，待进行RT-PCR。

2.扎鲁司特对LTC₄刺激气道结构细胞ET-1 mRNA表达及ET-1分泌的影响：将16-HBE及ASMC(来源同上)均分为5组(16-HBE：ELZ 0～4组)，每组4孔，每组加入相同浓度的LTC₄ (10^-8 mol/L)， 但加入不同浓度扎鲁司特，其浓度分别为0、10^-12 mol/L、10^-10 mol/L、10^-8 mol/L、10^-6 mol/L。加LTC₄和扎鲁司特后继续培养24 h，收集细胞培养液待进行ET-1水平测定。收集扎鲁司特浓度为0(SLZ 0组)及10^-8 mol/L(SLZ 3组)2孔细胞提取总RNA，待进行RT-PCR。

3.ET-1水平测定：用酶联免疫吸附(ELISA)法测定ET-1(美国R&D公司)水平。

4.RT-PCR测定ET-1基因表达水平^［4］：采用异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA。采用美国Promega公司逆转录试剂盒逆转录合成cDNA，然后通过PCR扩增ET-1 cDNA和β-actin cDNA。ET-1引物序列：上游：5′AACCATGGATTATTTGTCCATG3′，下游：5′AGTGTTGACCCAAATGATGTC3′，此对引物扩增出一条230 bp的ET-1 cDNA片段。β-actin引物序列：上游：5′ATCTGACACCACACCTTCTACAATGAGC TGCG3′，下游：5′CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCAC ATCTG 3′，此对引物可扩增出一条838 bp的β-actin cDNA片段。PCR反应条件为：94 ℃变性1 min， 59 ℃退火1 min，72 ℃延伸 1 min，共进行35个循环，72 ℃加强延伸7 min。

统计学处理：采用Origin 4.1统计软件，数据以±s表示，组间采用两个样本均数t检验来比较。

结果

一、LTC₄对16-HBE及ASMC ET-1mRNA表达及ET-1分泌的影响

LTC₄可刺激16-HBE及ASMC分泌ET-1，当LTC₄浓度≥10^-8 mol/L时，两种细胞ET-1分泌水平均显著高于对照组(P均＜0.05，图1)。 LTC₄可使两种细胞ET-1mRNA表达水平显著上调，16-HBE由0.19±0.15上调至0.43±0.2（t=7.160，P=0.005)；ASMC由0.38±0.14上调至0.54±0.14（t=4.833，P=0.017)。

二、扎鲁司特对LTC₄诱导16-HBE及ASMC ET-1 mRNA表达及ET-1分泌的影响

扎鲁司特可抑制LTC₄诱导16-HBE及ASMC释放ET-1，当扎鲁司特浓度≥10^-8 mol/L时，两种细胞ET-1分泌水平明显低于对照组［16-HBE：(12.7±1.3) ng/L降至(5.5±2.6) ng/L，t=4.693，P=0.019；ASMC：(7.5±1.0) ng/L降至(4.4±0.9) ng/L，t=5.003，P=0.007，表 1］。扎鲁司特对LTC₄诱导16-HBE及ASMC分泌ET-1的剂量-效应关系均呈显著直线负相关(16-HBE：r=-0.9177，P=0.0289；ASMC：r=-0.9451，P=0.0153)。