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【摘要】目的探讨利用无创伤性方法寻找较为特异性地反映哮喘患者气道炎症的客观指标。方法通过研究哮喘患者气道粘膜细胞粒-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF） mRNA表达，并以此为参照，分析哮喘患者诱导痰细胞GM-CSF mRNA表达变化，利用免疫组化结合逆转录聚合酶链反应（RT-PCR)技术，分析哮喘组（10例）气道粘膜细胞GM-CSF mRNA的表达；用3%高渗盐水诱导痰液，利用RT-PCR技术分析哮喘组(15例)、慢性支气管炎组（15例）和对照组（11例）诱导痰细胞GM-CSF mRNA表达。结果（1）哮喘组气道粘膜嗜酸细胞、淋巴细胞和活化嗜酸细胞（EG+2细胞）分别为（17.9±7.0）×102、（36±13）×102和（8.9±3.0）×102个/mm2，对照组分别为（1.9±1.0）×102、（6±5）×102 和（0.8±0.2）×102个/mm2，EG2细胞数与病情程度呈正相关(r=0.82，P＜0.05)；（2）哮喘组气道粘膜细胞GM-CSF mRNA表达为(1.4±0.6)，与对照组(0.3±0.3)比较，差异有显著性(P＜0.05)，并且GM-CSF mRNA的表达与EG+2细胞数明显相关(r=0.73，P＜0.05)。（3）哮喘组诱导痰嗜酸细胞相对计数为（0.334±0.067），与慢性支气管炎组的（0.021±0.004）和对照组的（0.008±0.003）比较，差异均有显著性(P＜0.05)；（4）哮喘组诱导痰细胞GM-CSF mRNA表达为(0.320±0.054)，与慢性支气管组的(0.188±0.024)和对照组的(0.058±0.028)比较，差异均有显著性(P＜0.05)；慢性支气管炎组与对照组比较，差异也有显著性(P＜0.05)。结论诱导痰细胞GM-CSF mRNA过度表达能够较为特异地判断哮喘气道炎症。
Expression of GM-CSF mRNA in asthmatic patients
ZHANG Wei，ZHONG Nanshan，XU Jun.
（Guangzhou Institute of Respiratory Diseases, Guangzhou 510120, China）
【Abstract】ObjectiveTo explore non-invasive and specific markers for airway inflammation.Methods RT-PCR methods were used to measure GM-CSF mRNA expression in airway mucosa and induced sputum from asthmatic patients. The correlation was analyzed between expression of GM-CSF mRNA and eosinophils or other inflammatory cells.Results (1) The numbers of eosinophils and EG2 positive cells were (17.9±7.0)×102 per mm2, and (8.9±3.0)×102 per mm2 in the asthmatic group, significantly higher than those in the non-asthmatic control which were (1.9±1.0)×102 per mm2, and (0.8±0.2)×102 per mm2, respectively (P＜0.05). (2) The expression of GM-CSF mRNA was (1.4±0.6) in the asthmatic group, significantly higher than that in the control group (0.3±0.3) (P＜0.05), and GM-CSF mRNA expression was correlated with the numbers of EG2 positive cell (r=0.73 and P＜0.05). (3) The percentage of eosinophils in induced sputum from asthmatic patients was （0.334±0.067）, which was significantly higher than that from chronic bronchitis and control (0.021±0.004),（0.008±0.003）（P＜0.05). (4) The expression of GM-CSF mRNA in asthmatics was (0.320±0.054), significantly higher than that in chronic bronchitis and the control group (0.188±0.024 and 0.058±0.028)（P＜0.05). The expression of GM-CSF mRNA in patients with chronic bronchitis was also significantly higher than that in the control group (P＜0.05).Conclusions The expression of GM-CSF mRNA in induced sputum may be a relatively specific marker for airway inflammation.
【Key words】Asthma;Airway inflammation;Granulocyte macrophage-colony stimulating factor
支气管哮喘基本的病理特征是由多种细胞包括肥大细胞、嗜酸细胞和淋巴细胞等参与形成的气道慢性炎症。活化嗜酸细胞（EG+2细胞）是气道炎症的主要效应细胞，细胞因子在炎症形成和维持中起重要的调节作用。粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)通过调节嗜酸细胞活化、粘附和趋化等在气道炎症形成和维持中起重要作用［1，2］。哮喘患者气道EG+2细胞数增加与气道粘膜细胞GM-CSF mRNA 表达总量的关系，目前报道较少。我们通过分析哮喘患者气道粘膜细胞GM-CSF mRNA表达与嗜酸细胞、临床表现的关系，在分子水平上寻求反映气道炎症指标，并以此为基础进一步分析哮喘患者诱导痰细胞GM-CSF mRNA的表达，旨在通过非创伤性方法寻找反映哮喘气道炎症较为理想的客观指标。
对象与方法
一、对象
将行纤维支气管镜（纤支镜）检查的18例受试者分为两组。哮喘组10例，男3例，女7例，平均年龄（33±3）岁，诊断参照1997年中华医学会呼吸病学分会哮喘学组推荐标准，病情分级按照哮喘非急性发作期分级［3］。根据美国心肺血液研究院（NHLBI）关于哮喘患者纤支镜检查指南中的规定，我们选择临床分级在Ⅰ～Ⅲ级的哮喘患者。其中病情分级为I级者3例，Ⅱ级者3例，Ⅲ级者4例。对照组8例，男4例，女4例，平均年龄（34±3）岁，均为肺内局部阴影需作纤支镜检查的非哮喘患者。哮喘组和对照组患者均为广州呼吸疾病研究所门诊或住院患者。
将行诱导痰检查的41例受试者分为三组。哮喘组15例， 男7例，女8例，平均年龄（37±3）岁，其中病情分级为I级者3例，Ⅱ级者3例，Ⅲ级者4例，Ⅳ级者5例。诱导痰检查与上述纤支镜检查者之间无重复。慢性支气管炎组15例，男9例，女6例，平均年龄（58±2）岁，对照组11例（1例诱导痰失败），男5例，女6例，平均年龄（39±3）岁。所有受试者试验前2周内均未口服和吸入糖皮质激素，6个月内未肌肉注射糖皮质激素。哮喘和慢性支气管炎组患者均来自广州呼吸疾病研究所门诊或住院部，对照组来自广州呼吸疾病研究所职工体检自愿者。
二、样本的制备
进行纤支镜检查的患者，每例于右上叶嵴、右中叶嵴分别钳取粘膜组织3～4块，2块放入1%多聚甲醛中固定，其余放入4 mol/L D 液［250 g异硫氰酸胍（美国Serva公司） 65 ℃溶于293 ml水中，加入0.75 mol柠檬酸钠液17.6 ml和10% N-十二烷基肌氨酸钠26.4 ml混匀，0.22 μm滤膜过滤后4 ℃备用，使用前取100 ml加入0.7 ml β-巯基乙醇混合后即D液］的Eppendoff管提取细胞总RNA。将固定的组织块经酒精梯度脱水、透明处理、浸蜡、石蜡包埋后连续切3张片，每张厚度4 μm，第1张行HE染色，第2和第3张组织切片均用链霉素抗生物素-过氧化酶连接法（SP）进行免疫组化染色。第2和第3张切片分别加入磷酸盐缓冲液（PBS）、抗活化嗜酸细胞（EG2）单抗(羊抗人，浓度1∶10，美国PharMingen公司)作为第一抗体，SP试剂盒(丹麦DAKO公司)，DAB显色，阳性反应呈棕褐色，加入抗EG2单抗的玻片最终经伊红染色，阳性反应呈棕红色颗粒。
三、操作步骤
用3%高渗盐水，经射流式雾化器（雾化颗粒平均直径4.8 μm）使受试者雾化3～30 min，将诱导痰液4～5口留置在培养皿中，尽量除去唾液，加入10%连硫苏糖醇5～10 ml，冰浴下吹打至痰液粘稠度下降，将混合液充入细胞计数池进行白细胞计数；其余液体经1 000 r/min离心10 min，弃上清，取少许细胞沉淀涂片后经HE染色，按常规方法细胞分类计数。
气道粘膜组织诱导痰细胞总RNA提取按照异硫氰酸胍一步法［4］，逆转录试剂盒(美国Promega公司)，PCR试剂盒(北京华美生物工程有限公司)，PCR引物合成(上海细胞所合成)，β-actin引物序列［5］：上游5′ATG TGG CAC CAC ACC TTC TAC AAT GAG CTG CG 3′，下游 5′CGT CAT ACT CCT GCT TGC TGA TCC ACA TCT GC 3′，此对引物可扩增出836 bp的片段；GM-CSF引物序列［6］：上游5′ATG TGG CTG CAG AGC CTG CTG C 3′，下游5′CTG GCT CCC AGC AGT CAA AGG G 3′，此对引物可扩增出424 bp的片段。PCR反应条件：变性温度94 ℃、时间1 min，退火温度55 ℃、时间2 min，延伸温度72 ℃、时间2 min，共40个循环；加强延伸温度72 ℃、时间10 min，4 ℃保存。反应完成后，取15 μl PCR产物和PCR Marker（分子量标准）点样在1.5% 琼脂糖凝胶的样板孔里，凝胶中含有0.5 μg/ml的溴化乙锭(EB)显色，电泳电压0.5 V/cm、时间60 min。电泳结束后，立即在紫外图像分析仪（英国UVP公司）摄影记录和测定荧光亮度，最后计算样本GM-CSF与β-actin荧光亮度比值。
四、统计学处理
所有数据经SPSS软件处理，数值以±s表示，两组间均数的比较采用方差分析，相关分析采用Spearman相关分析，样本间百分含量比较采用Kruskal-Wallis检验。
结果
