关键词： 哮喘；过氧亚硝基阴离子；气道高反应性；豚鼠

【摘要】目的探讨哮喘豚鼠肺内过氧亚硝基阴离子（ONOO^-）的生成及其在哮喘气道高反应性形成中的作用。方法18只哮喘豚鼠模型随机分为3组：（1）哮喘组（6只）：用10%卵蛋白1 ml腹腔注射致敏，2周后用1%卵蛋白超声雾化吸入复制豚鼠哮喘模型。（2）哮喘加氨基胍（AG）组（6只）：诱喘同哮喘组，在每次诱喘前1 h腹腔注射AG 10 mg/kg。（3）正常对照组（6只）：用生理盐水代替诱喘剂。每组哮喘豚鼠均用免疫组织化学技术检测肺内ONOO^-的生成及定位；用健康豚鼠15只制备气管条，观察外源性ONOO^-对离体豚鼠气管条反应性的影响，电镜观察ONOO^-对气道上皮细胞的损伤情况。结果哮喘豚鼠支气管肺组织中有ONOO^-特异性标志物-硝基酪氨酸（NT）的过量生成，主要分布于气道上皮细胞和小气道周围炎性细胞内；加用AG组，NT阳性细胞减少；正常对照组仅有较少的NT阳性细胞；ONOO^- 0.5mmol/L组气管条对各浓度组胺(10^-8mol/L除外)的反应性与溶剂对照组比较，差异有显著性(P分别＜0.05、＜0.01及＜0.001)；ONOO^- 0.5 mmol/L组气管条对组胺反应的敏感性与溶剂对照组比较，差异有显著性（P＜0.001）；电镜观察ONOO^-可致气管粘膜上皮细胞损伤、脱落。结论哮喘豚鼠气道上皮细胞内有过量ONOO^-生成，ONOO^-可能通过介导气道上皮细胞损伤参与哮喘气道高反应性的形成。

Role of peroxynitrite on airway hyperresponsiveness in asthmatic guinea-pigs

ZHU Tienian，LING Yiling，ZHAO Ruijing,et al.

（Department of Pathophysiology，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China）

【Abstract】ObjectiveTo study the formation and localization of peroxynitrite(ONOO^-) in the lung tissues of asthmatic guinea pig and investigate the effects of ONOO^- on airway hyperresponsiveness in asthma.Methods 18 guinea pigs were randomly divided into three groups of 6 each: (1) asthmatic group: guinea pigs were injected intraperitoneally with 1 ml of 10% ovalbumin. After 14 days，the animals were exposed to aerosol of 1% OVA; (2) aminoguonidine (AG) group: Animal immunization was the same as above，but 1 h before the animals were exposed to OVA aerosol，10 mg/kg AG were injected intraperitoneally.(3) control group. The formation and localization of ONOO^- in the lung tissues of the guinea-pig asthma model were observed by immunohistochemical detection. The effect of exogenous ONOO^- on contractions of isolated tracheal strips of the guinea-pigs to various concentrations of histamine was examined. The damage of airway epithelial cells induced by ONOO^- was observed by electron microscopy.Results There was strong immunoreactivity for nitrotyrosine (NT)，a specific marker of ONOO^- formation in vivo，in the airway epithelisl cells and inflammatory cells surrounding small airways of the guinea-pigs with asthma. The AG group showed significantly decreased number of NT positive cells in the lung tissues. There were only a few NT positive cells in the control group. The responsiveness of isolated tracheal strips to various concentration of histamine（except 10^-8mol/L） in the ONOO^- 0.5 mmol/L group were significantly increased compared with the vehicle group. (P＜0.05,P＜0.01 or P＜0.001). The sensitivity of isolated tracheal strips to histamine in the ONOO^- 0.5mmol/L group were also increased compared with the vehicle group（P＜0.001). Electron microscopical observation of the airways revealed airway epithelial injury and shedding.ConclusionThere was ONOO^- overproduction in airway epithelial cells of asthmatic guinea-pigs，which may contribute to airway epithelial damage and hyperresponsiveness in asthma.

【Key words】Asthma；Peroxynitrite；Airway hyperresponsiveness；Guinea-pig

新近研究表明，在体内一氧化氮（NO）与超氧阴离子（）可快速反应形成氧化作用更强的过氧亚硝基阴离子（ONOO^-），其生物学作用可介导多种细胞损伤，是NO产生病理性损伤的主要发病环节^［1］。Ischiropoulos等^［2］发现，ONOO^-可使蛋白质酪氨酸残基硝基化生成代谢物硝基酪氨酸（NT），而、NO及其氧化还原形式则无此作用，目前公认，NT是ONOO^-在体内生成的特异性标志物。应用免疫组织化学技术证实，在急性肺损伤、内毒素血症、肺缺血再灌注损伤等多种与NO和过量产生有关的病理过程中肺组织均有ONOO^-特异标志物NT产生^［3］。哮喘发病过程中气道上皮细胞及多种炎细胞如嗜酸细胞、中性粒细胞、巨噬细胞等活化可诱生大量NO和^［4］，关于哮喘发病过程中气道上皮细胞内是否有ONOO^-生成及其在气道反应性中的可能作用，目前国内、外报道较少。我们的研究旨在应用豚鼠哮喘模型，观察哮喘豚鼠肺内ONOO^-的生成及其定位，以及外源性给予ONOO^-对离体豚鼠气管条反应性的影响，探讨哮喘发病过程中气道上皮细胞内ONOO^-生成及其在哮喘气道高反应性形成中的可能作用。

材料与方法

一、材料

1．实验动物：健康Dunkin-Hartly豚鼠33只，雌雄不拘，体重350～450 g，由河北省实验动物中心提供。

2．试剂：卵蛋白、诱导型NO合酶（iNOS）抑制剂氨基胍（AG），二氨基联苯胺（DAB）及磷酸组胺（histamine）均为美国Sigma公司产品，硝基酪氨酸单克隆抗体购自美国Cayman公司，试剂盒即过氧化物酶标记的链霉素-亲和素试剂盒，为美国Zymed公司产品，其余试剂均为国产分析纯。

二、方法

1．哮喘豚鼠模型的建立及分组：（1）哮喘组（6只）：用10% 的卵蛋白生理盐水腹腔注射致敏，2周后用1%的卵蛋白生理盐水雾化吸入激发；（2）哮喘加AG组（6只）：抗原激发前1 h腹腔注射AG 10 mg/kg；（3）对照组（6只）：用同样的方法致敏，但用生理盐水代替1% 的卵蛋白生理盐水雾化吸入激发。

2．免疫组织化学染色：各组豚鼠分别于激发后12 h，过量戊巴比妥钠腹腔注射处死，取右下肺组织，10%福尔马林溶液固定，常规石蜡包埋，切片，用于免疫组化和HE染色。SP免疫组化染色步骤：3% H₂O₂甲醇溶液室温孵育15 min，封闭内源性过氧化物酶活性；10%正常山羊血清室温孵育10 min，封闭非特异性抗原抗体反应；鼠抗硝基酪氨酸单克隆抗体（10 μg/ml）4°C过夜；生物素标记的羊抗鼠IgG 37 ℃ 30 min；辣根酶标记的链霉卵白素37 ℃ 30 min；DAB呈色，苏木素复染。以上各步骤间均以0.01 mol/L（pH 7.2）PBS液彻底冲洗。最后脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

免疫组化染色对照设置：以PBS液（pH 7.2）代替一抗行上述染色作为空白对照。

3．ONOO^-的合成：参照Beckman等^［1］方法通过淬灭流动反应器(quenched-flow reactor)合成ONOO^-，应用日本岛津UV-2201紫外分光光度计测定波长302 nm的ONOO^-浓度，-80 ℃冰箱储存备用。将ONOO^-储存液于100 ℃加热5 min，制备分解的ONOO^-作为分解产物对照。

4．离体气管条对组胺反应性的测定：健康豚鼠15只，击头处死后，剖取气管，沿前正中线纵行切开，以每3个软骨环为一组横切制成气管条。实验分组(每组9条)：(1) ONOO^- 0.5 mmol/L组；(2) ONOO^-分解产物组；(3) 溶剂对照组：溶剂为与(1) 组等pH的0.9%生理盐水。将制备好的气管条悬挂于盛有6 ml Krebs液（NaCl 118 mmol/L，KCl 4.7 mmol/L，CaCl₂ 2.5 mmol/L，MgSO₄ 1.2 mmol/L，KH₂PO₄ 1.2 mmol/L，NaHCO₃ 25 mmol/L，葡萄糖11.1 mmol/L）浴槽中，37 ℃恒温，持续通95％ O₂和5％ CO₂混和气体。MS-302多媒体化生物信号记录分析系统记录气管条张力变化。以0.1 mmol/L组胺预收缩气管条，于气管条恢复基础张力后，在浴槽中加入ONOO^-避光孵育15 min，更换Krebs液，至肌条稳定后，用累积方法建立组胺累积浓度-反应曲线。