设为首页
加入收藏
求医中医药网
www.qe.cn
站内搜索
【摘要】目的了解结核分支杆菌重组38 000蛋白(rMT38)诱发家兔产生抗体的能力及作为血清学诊断试剂的价值。方法将家兔分为6组：PPD＋生理盐水(A组)，rMT38＋生理盐水(B组)，rMT38＋佐剂(C组)，1/2 rMT38＋1/2 rMT16＋生理盐水(D组)，1/2 rMT38＋1/2 rMT16＋佐剂(E组)，rMT16＋佐剂(F组))。用ELISA法测C、E两组血清是否与分支杆菌PPD有交叉反应。双向扩散和ELISA法检测rMT38免疫的血清反应。ELISA法检测389份人血清，包括肺结核病人145例、卡介苗接种阳转健康者78例、健康献血者105例、非结核呼吸道疾病31例及脓肿分支杆菌感染者30例。结果C、E两组血清用双向扩散和ELISA检测抗体滴度分别为1∶16、1∶4和1∶6 400、1∶3 200； 双向扩散检测A、B、D、F组血清与rMT38均未见免疫沉淀线；ELISA检测A、F组血清，抗体为阴性，B、D组抗体滴度均为1∶400。C组血清与所试分支杆菌PPD用ELISA 检测均为阴性；E组血清与牛、结核分支杆菌PPD呈阳性反应。兔血清抗体效价结果显示：5个月后，C、E组血清效价均下降，但仍能检测到抗体；B、D组血清2个月抗体检测为阴性。肺结核病组rMT38和PPD检测敏感性分别为69.0%和75.2%；健康组、非结核呼吸道疾病组、卡介苗接种阳转健康组及脓肿分支杆菌感染组rMT38和PPD检测特异性分别为97.1%、93.5%、86.0%、53.6%和94.3%、87.1%、67.9%、39.3%。结论rMT38具有较强免疫原性，可能成为结核病血清学诊断试剂之一。
The immunogenic characteristics of the recombinant 38 000 antigen from Mycobacterium tuberculosis
HE Xiuyun，ZHUANG Yuhui，ZHANG Xiaogang，et al.
（Tuberculosis Research Laboratory, The 309 th Hospital of PLA, Beijing 100091，China）
【Abstract】ObjectiveTo study the ability of recombinant 38 000 protein of Mycobacterium tuberculosis (rMT38) to induce antibodies and its value as a serological diagnostic reagent.Methods Rabbits were divided into six groups, namely： PPD + physiological saline(group A), rMT38+physiological saline(group B), rMT38+adjuvent(group C), 1/2 rMT38+1/2 rMT16+physiological saline(group D), 1/2 rMT38+1/2 rMT16+adjuvent(group E), rMT16+adjuvent(group F). The sera from the immunized rabbits and the sera immunized by mycobacteria were evaluated by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) and bilateral agar diffusion assay (BADA). 389 human sera, including 145 patients with pulmonary tuberculosis，105 healthy controls，31 non-tuberculosis respiratory patients，78 BCG-vaccinated healthy controls and 30 patients with M. abscessus infection , were detected by ELISA.Results Titers of specific antibodies in sera from C and E groups were 1∶16 and 1∶4 in BADA, and 1∶6 400 and 1：3 200 in ELISA，respectively. Precipitate lines of sera from A，B，D，F groups reacting with rMT38 were not found by BADA. Sera titer of A，B，D，F groups were negative，1∶400，1∶400，and negative by ELISA, respectively. Sera from E group had no reaction with PPD from thirteen mycobacteria, however, sera from E group reacted with PPD from Mycobacterium tuberculosis and BCG. Sera titer of all rabbits decreased with time. After two months, serum titers in B and D groups became negative. However, antibodies were still found in C and E groups after five months. The sensitivity of rMT38 and PPD in detecting pulmonary tuberculosis were 69.0% and 75.2%, respectively. The specificity of rMT38 and PPD in detecting healthy controls，non-tuberculosis respiratory patients，BCG-vaccinated healthy controls and M. abscessus-infected patients were 97.1%，93.5%，86.0％，53.6% and 94.3％，87.1％，67.9%，39.3% respectively.Conclusion rMT38 has a strong immunogenicity，which may be used as an immunodiagnostic reagent for tuberculosis.
【Key words】Mycobacterium tuberculosis；38 000 protein；Immunologen；Serological diagnosis
结核分支杆菌（MTB）耐药菌株传播及人免疫缺陷病毒（HIV）感染合并结核病已经引起人们的关注［1］。结核病的早期诊断、及时治疗、新疫苗研制显得极为迫切。基因工程技术实现了MTB蛋白抗原在真核系统、原核系统表达［2，3］，使抗原大量获得的难题得到了解决。研究发现，热休克蛋白具有保守性，易产生交叉反应; 分泌蛋白相对分子质量较小，免疫保护性作用不太理想［4，5］。MTB 38 000蛋白具有强的免疫原性［6］，可能与MTB的能量代谢有关，因在磷饥饿培养条件下，MTB合成38 000蛋白增加［7］。38 000蛋白是MTB相对特异的蛋白，只存在于MTB复合体，并具有两个特异的B细胞抗原决定簇, 对应单克隆抗体为TB71和TB72［8］。鉴于此，MTB 38 000蛋白可用于结核病的血清学诊断［9，10］。我们在完成结核分支杆菌38 000蛋白编码基因在大肠杆菌中高效表达及重组抗原纯化的基础上，对重组38 000蛋白是否保留其免疫原性及其用于血清学诊断的敏感性和特异性进行了试验论证。
材料与方法
一、 材料
1.家兔： 2.0 ～ 2.5 kg, 健康，雌雄各半。分支杆菌PPD： 购自中国药品生物制品检定所。rMT38、rMT16为本室自制［11，12］。
2.血清来源：肺结核病145例选自北京胸科医院，健康献血者105例血清取自本院血库，非结核呼吸道疾病(非结核病)31例选自济南军事医学研究所，卡介苗接种皮试阳转健康者(卡介苗阳转)78例选自济南军事医学研究所，脓肿分支杆菌感染组30例选自深圳市卫生防疫站。分支杆菌免疫羊血清为本室冷冻保存。
二、方法
1.家兔免疫：将抗原溶液与等体积的不完全弗氏佐剂乳化均匀或与生理盐水混匀后于家兔皮下多点注射，每只注射蛋白总量为0.5 mg，共免疫6次。
实验动物分组：A组：PPD＋生理盐水；B组： rMT38＋生理盐水；C组：rMT38＋佐剂；D组：1/2 rMT38＋1/2 rMT16＋生理盐水；E组：1/2 rMT38＋1/2 rMT16＋佐剂；F组： rMT16＋佐剂。
2.酶联免疫吸附试验（ELISA）：rMT38与PPD分别稀释成合适浓度，每孔100 μl, 4 ℃过夜。倒掉包被液，磷酸盐缓冲液（PBS）-0.5% Tween 20(PBST)洗板3次，每次3 min；含1%牛血清白蛋白的PBST按合适的比例稀释血清，每孔100 μl， 37 ℃，1 h；同前洗板3次；按说明稀释辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，每孔100 μl，37 ℃，1 h； 同前洗板3次；12.5 ml柠檬酸钠-Na2HPO4缓冲液溶解5 mg 二氨基联苯胺（DAB），临用前加15 μl 30% H2O2，每孔100 μl，显色10 min 左右，加2 mol/L H2SO4中止反应，490 nm测定吸光度（A）值。
3.双向琼脂扩散实验：参见文献［13］。
4. 统计分析：ELISA临界值确定为健康献血组平均A值± 2 s，PPD与rMT38检测血清的敏感性和特异性差异采用χ2检验。
结果
一、兔血清效价检测及其特异性
双向琼脂扩散：A、B、D、F组均未见抗原抗体反应沉淀线，C、E组抗体滴度分别为1∶16、1∶4。ELISA：A、B、C、D、E、F组抗体滴度分别为阴性、1∶400、1∶6 400、1∶400、1∶3 200、阴性。此后连续观察5个月，每月取一次血，每次所取兔血清以1∶100稀释后用ELISA测定吸光度值，结果表明，B、C、D、E组抗体滴度均呈下降趋势，2个月B、D组抗体检测为阴性。结果见图1。双向琼脂扩散法示rMT38只与结核分支杆菌、卡介苗免疫的羊血清形成白色沉淀线，而PPD与胞内分支杆菌外的分支杆菌免疫的血清形成白色沉淀线。ELISA 示rMT38与结核分支杆菌、卡介苗、耻垢分支杆菌免疫的血清产生阳性反应；胞内分支杆菌外的所试分支杆菌免疫的血清均与PPD呈阳性反应（表1）。ELISA检测受试分支杆菌PPD和兔血清反应结果显示：C组兔血清与13种分支杆菌PPD反应均为阴性；而E组兔血清与牛、结核分支杆菌PPD产生阳性反应，还与胃、土地分支杆菌PPD产生弱阳性反应。见表2。
二、结核病血清学诊断
PPD和 rMT38检测肺结核病总的敏感性分别为75.2%、69.0%;其中涂片阴性、涂片阳性、未查涂片 PPD检测的敏感性分别为69.2％、100.0%、67.5％，rMT38检测的敏感性分别为66.7%、96.7%、51.4%; PPD和rMT38检测健康献血组阳性数分别为6和3，特异性分别为94.3%、97.1%；非结核病组，PPD、rMT38检测阳性数分别为4、2，特异性分别为87.1%、93.5%；卡介苗阳转组，PPD、rMT38检测阳性数分别为26、11，特异性分别为67.9%、86.0%，差异有显著性(P＜0.01) 。脓肿分支杆菌感染组，PPD、rMT38检测阳性数分别为17和13，特异性分别为39.3%和53.6%。见表3。
