为寻找结核分支杆菌株特异标记物，采用随机扩增DNA（RAPD）鉴定结核分支杆菌指纹，并对部分感染源进行了同源性分析。材料与方法标准菌株为结核分支杆菌H₃₇Rv 93009、H₃₇Rv、H₃₇Rv、H₃₇Rv 9320及H₃₇Ra。临床株 6株，其中取自母女患者各1株，另4株来自一组暴发流行的肺结核患者（同居外来民工）。分离采用琼脂培养基^［1］；所有临床株经生化等证实为结核分支杆菌。(1)DNA提取：采用标准酚-氯仿纯化法（略）和煮沸冻融法及碱洗法等粗提法。碱洗法以0.5 mol/L NaOH+0.5 mol/L柠檬酸钠混合物1 ml与菌落3～5 mg放入1.5 ml Ep管内充分混匀，静置10 min，离心（13 000 r/min，5 min），0.5 ml 2 mol/l Tris·HCl(pH 8.0)缓冲液洗脱2次，0.2 ml双蒸水重悬菌，95℃水浴20 min，取上清。 煮沸冻融法取1.5 ml Ep管，双蒸水1 ml，菌落3～5 mg混匀，95℃水浴20 min杀菌，-20℃速冻及65℃水浴解冻，反复8次，取上清。(2)聚合酶链反应：总反应体积50 μl，其中模板1～2 μl，引物0.4 μmil/L（北京赛百盛生物工程公司，聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化），Taq DNA聚合酶（Promega 公司）2.5 U，dNTP 200 μmol/L，1×PCR缓冲液。扩增用美国ERICOMP 公司水冷式温度循环仪。热循环为：94℃预热3 min； 94℃变性20 s， 36℃复性1 min， 72℃延伸1 min，35次循环结束后温育10 min。(3)DNA分析：扩增物以1.5％的琼脂糖凝胶电泳。上样量每孔5～6 μl，电泳缓冲液为0.5×TBE。结果模板：标准法提得DNA浓度为100 ng/μl，纯度1.43 以上。其它方法提取DNA浓度相近，但纯度低，RAPD图形较模糊，相邻带不易区分。引物：9条20 mer和3条10 mer寡核苷酸引物中仅两条具有较强的分辨力(MT1 5′TTCCTACCAGCGAGCTGCCG 3′,IS986 5′ACGCTCAACG-CCAGAGACCA 3′)，带谱差别明显。引物浓度0.1～0.6 μmol/L对指纹图的多态性无明显影响。退火温度：35～40℃对RAPD结果影响不大，但50℃以上则多态性明显降低。6例临床株指纹鉴定：用MT1和IS986分别或联合鉴定了6株临床株的RAPD指纹。结果MT1多态性好，但对例1、2与例4、5不能区别；IS986的多态性不如MT1，但其分辨力高，能将6例菌株分成3种带型。二引物联合鉴定多态性下降，分辨力未变，弥补了IS986单独扩增的不足。 讨论80年代以来的核酸指纹技术，因分支杆菌无质粒而无法开展质粒法；脉冲场凝胶电泳（PFGE）法需较昂贵的仪器，部分分支杆菌因自溶而无法鉴定^［2］。最常用的遗传标记-IS6110限定性片段长度多态性(RLFP)已被建议作为检测结核分支杆菌DNA的一个基因靶^［3］，但其技术复杂、费时而应用受限，且一些结核分支杆菌基因组DNA中无IS6110插入序列，使得其实用性受到怀疑。1990年由Welsh等^［4］和Williams等^［5］几乎同时建立的RAPD分析技术为核酸指纹分析找到了一条有效简捷的技术路线。本试验6株临床株中母女2人的分离株经2种引物独自及联合鉴定DNA带型均一致，说明它们之间有很好的同源性，很可能为同一感染源所致；而其它4例分离株的DNA带谱各有差异，同源性较差，可能为原有病灶复发导致患病。要取得重复性好、灵敏度高的DNA指纹鉴定结果，进行RAPD实验应注意以下几点：(1)提取DNA时动作要轻柔，吸取DNA时要用大口径吸管，尽可能保证DNA链的完整，冻存时间不超过1个月，最好即提即用；(2)尽量避免污染，最好将试剂总量分装，最后加入模板；(3)扩增过程中一定要设一无模板的空白对照并设标准DNA标记物；(4)Taq DNA聚合酶要注意筛选；(5)引物浓度要适当，要经预试验确定。

参考文献1，匡铁吉，宋萍，王利平，等.分支杆菌简化琼脂培养基研究.微生物学报，1995，35：298-302.2，Wallace RJ,Zhang Y,Brown BA,et al.DNA large restriction fragment patterns of sporadic and epidemic nosocomial strains of Mycobacterium chelonae and Mycobacterium abscessus.J Clin Microbiol，1993，31:2697-2701.3，Patel S,Wall S,Saunders NA.Hemi-nested inverse PCR for IS6110 fingerprinting of Mycobacterium tuberculosis strains.J Clin Microbiol，1996，34:1686-1690.4，Welsh J,McClelland M.Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers.Nucleic Acids Res,1990，18:7213-7218.5，Williams JGK,Kubelik AR,Livak KJ,et al.DNA polymorphism amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers.Nucleic Acids Res,1990，18:6531-6535.

(收稿日期：1999-09-17)