在分支杆菌菌型鉴定中，常用尼克酸试验鉴定结核分支杆菌与牛分支杆菌及其它非结核分支杆菌
［1］。结核分支杆菌能分泌大量的尼克酸至培养基中，而其它分支杆菌则不能
［2］。据报道，这是由于结核分支杆菌具有很强的尼克酸二核苷酸（NAD）糖水解酶及脱酰胺酶的作用，能将NAD迅速分解为尼克酸（NA），但由于它的尼克酸磷酸核糖转移酶很弱，不能将尼克酸重新合成NAD参加循环，而将尼克酸释放到培养基中。为了更深入地了解尼克酸磷酸核糖转移酶的作用，我们筛选了非结核分支杆菌中的鸟分支杆菌噬菌体基因文库，克隆到了编码尼克酸磷酸核糖转移酶的基因pncB。 材料与方法根据结核分支杆菌pncB基因设计一对引物，以结核分支杆菌DNA为模板进行聚合酶链反应（PCR），得到1.8 kb片段，将其纯化后，用随机引物探针标记试剂盒进行α-
32P标记作为筛选基因文库的探针。筛选基因文库：用稀释后的鸟分支杆菌λ gt11基因文库和大肠杆菌混合，铺入LB板顶层胶，倒置后37℃过夜。将噬菌斑转移至尼龙膜，经变性、中和、与探针杂交、洗膜、待干，覆以底片放射自显影后，与噬菌体生长的LB板对照，挑选出阳性杂交的噬菌斑，扩增生长后提取噬菌体DNA。亚克隆：噬菌体DNA用内切酶酶切后，用结核分支杆菌的pncB基因PCR产物为探针与其杂交,与大肠杆菌酶切产物杂交得到两条阳性杂交带,说明这两条DNA带包含有pncB基因,一条为3.5 kb(将其命名为10B),另一条为2.5 kb(命名为10S)。转化：DNA片段10B、10S与质粒pUC19用T
4 DNA 连接酶连接，电击转化大肠杆菌感受态细胞后,挑取阳性克隆。测序：这两个阳性克隆所含片段的总和即是完整的pncB基因。将含有3.5 kb和2.5 kb插入片段的pUC19 大量提取质粒DNA，测序后得到了pncB基因的全序列。结果鸟分支杆菌尼克酸磷酸核糖转移酶基因pncB全序列全长为1 491 bp，推测蛋白质共497个氨基酸，相对分子质量为54 300，与结核分支杆菌的同源性为67%。讨论Gopinathan等
［3］曾报道，加热可以去除NAD糖水化酶的抑制物。异烟肼的一个可能的作用机制就是，能和这种抑制物结合，从而使NAD糖水解酶的活性释放出来，从而使细胞内的NAD排空
［4］，达到杀菌目的。吡嗪酰胺在pncA基因的产物吡嗪酰胺酶作用下转化为吡嗪酸，在结核分支杆菌中，由于尼克酸磷酸核糖转移酶活力很弱，吡嗪酸也被释放至细胞外。我们克隆到了编码尼克酸磷酸核糖转移酶的基因pncB,为从分子水平探讨分支杆菌NAD代谢及异烟肼、吡嗪酰胺的作用机制奠定了基础。目前，pncB基因的表达及其功能的研究正在进行之中。
参考文献1，Konno K,Kurzmann R,Bird KT.The metabolism of nicotinic acid in mycobacteria.A method for differentiating tubercle bacilli of human origin from other mycobacteria.Am Rev Tuberc，1957,75:529-537.2，Foster JW，Moat AG.Nicotinamide adenine dinucleotide biosynthesis and pyrine cycle metabolism in microbial systems.Microbio Rev，1980,44:83-105.3，Gopinathan KP,Sirsi M，Vaidyanathan CS.Nicotinamide adenine dinucleotide glycohydrolase of Mycobacterium tuberculosis H37Rv.Biochem J，1964,91:277-282.4，Suprakash KS，Ramarkrishan T.Isoniazid and nicotinamide adenine dinucleotide synthesis in Mycobacterium tuberculosis.Indian J Biochem，1969,6:49-52.
(收稿日期：1999-09-28)
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