生物被膜（BF）是单一或多种细菌粘附于物体或组织表面，增殖形成微定植，并大量分泌胞外多糖（EPS）而形成的一种结构复杂并具有一定功能的膜状结构。发生感染时体内生物材料和组织表面常有细菌BF的存在，这种感染被称为细菌BF相关性感染。BF细菌常对抗生素耐药，使得细菌BF相关性感染的控制十分困难。一些研究证实合并使用大环内酯类(14元环或15元环)抗生素可增强其他抗生素的疗效。有研究认为是大环内酯类抗生素抑制细菌的EPS的产生，增强其它抗生素的渗透性而起协同作用^［1，2］。亦有一些研究持不同的观点^［3，4］。我们通过建立铜绿假单胞菌的BF模型，采用激光共聚焦显微镜（SCLM）和扫描电子显微镜（SEM）从形态学方面观察克拉霉素（CAM）对铜绿假单胞菌BF作用，以期为临床使用克拉霉素辅助治疗BF相关性感染进一步提供实验依据。材料与方法(1)铜绿假单胞菌由上海中山医院临床微生物中心提供。(2)克拉霉素（美国雅培公司）；(3)胰酶肉汤培养液。(4)PBS缓冲液(pH 7.4)。(5)医用PVC片( NunC公司 )；96孔培养板(NunC公司);(6)扫描电镜(日立S-520型 )；激光共聚焦显微镜(Zessi LSM-510)。采用微量对倍稀释测定CAM对铜绿假单胞菌的最低抑菌浓度(MIC)，标准质控菌株是铜绿假单胞菌ATCC27853。参照Prosser等^［5］报道的方法加以改进建立成熟BF(8天)模型。将以上成熟铜绿假单胞菌BF分别放置肉汤培养液(对照组)和含有克拉霉素(8 μg/ml)肉汤培养液(30 ml)中，以上培养液每12 h更换1次。分别于2、8、16、24、36 h取出标本用PBS冲洗1次，分别放置无菌培养皿中和置于戊二醛固定液中分送SCLM室直接观察和电镜扫描。SCLM采用放大20倍镜头（H-NA-1.3），激光波长为488 nm的条件下观察。SCLM随机对铜绿假单胞菌BF的3个不同部位测定其BF厚度，并观察CAM作用BF不同时间后其培养液涂片。SEM样品制备：采用常规方法制备SEM样品，然后用SEM观察。结果(1)CAM MIC测定结果：CAM抑制铜绿假单胞菌所需MIC＞128 μg/ml。(2)SEM观察：成熟铜绿假单胞菌BF中细菌被浓厚的纤维样物质紧密包裹，细菌分布不均、层样重叠。细菌之间以粘稠的纤维相互连接，呈多层网状结构（图1）。SEM观察经CAM处理36 h后成熟铜绿假单胞菌BF的结构完全消失，仅可见BF碎片及浮游状态的铜绿假单胞菌。(3)SCLM观察：可清楚显示成熟BF的基本结构如微定植、隧道、胞外多糖（图2）。CAM处理2 h后成熟铜绿假单胞菌BF的典型隧道结构消失（图3）。经CAM处理8 h后成熟铜绿假单胞菌BF表面明显凹凸不平，呈现碎片脱落的痕迹（图4）。经CAM处理36 h后成熟铜绿假单胞菌BF的结构完全消失，仅见BF碎片,部分细菌呈长杆状，成对或短链排列相互间无粘液物质包裹，细菌长短不一，背景清晰，类似浮游状态的铜绿假单胞菌(图5)。在对照组的培养液以及经CAM处理成熟铜绿假单胞菌BF 2 h时获取培液涂片中，可见浮游状态的铜绿假单胞菌，未见铜绿假单胞菌BF的碎片。经CAM处理成熟铜绿假单胞菌BF 8、16、24、36 h后,在所有培养液涂片中均可见含大量细菌的膜样碎片和浮游状态的铜绿假单胞菌(图6)。(4)作用时间0、2、8、16、24 h标本BF厚度分别为(43.1±1.6)μm、(41.1±1.9) μm、(31.7±1.9) μm(14.2±4.1) μm、(4.9±2.9) μm。0与2 h组BF厚度比较，差异无显著性(P＞0.05)，其他各组之间BF厚度比较，差异有显著性(P＜0.01)。讨论SEM是常用的观察BF的方法，但因标本需严格的化学固定和脱水，常使其结构遭到破坏。本研究使用的铜绿假单胞菌株，CAM对其MIC是128 μg/ml，研究中使用的CAM浓度为8 μg/ml(1/16 MIC)，对实验菌无抑菌作用。因此，其对成熟铜绿假单胞菌BF的干预作用可能是通过抑菌作用以外的其他机制产生的。本实验发现CAM作用BF 2 h时，BF中典型微定植和隧道结构消失，表明CAM可破坏BF隧道系统，推测这种破坏作用可能会减少BF对渗入BF内的相应抗生素的排泄，增加BF内相应抗生素的浓度，从而在清除BF细菌中产生协同作用。另一方面，随着CAM对BF作用时间的延长，BF结构破坏更加明显，BF逐渐变薄，甚至结构消失，仅见少量碎片和粘附的细菌，同时在含CAM的培养液中可见BF碎片的存在，表明CAM作用于成熟的BF，导致BF裂解，形成碎片，并从表面逐渐脱落，部分形成浮游细菌。CAM破坏已形成的EPS分子结构的确切机制有待进一步深入研究。

图1成熟铜绿假单胞菌BF电镜扫描图图2成熟BF的SCLM水平层面图(距PVC18 μm)，微定植(白箭头)、隧道(黑箭头)图3经CAM处理2 h后成熟铜绿假单胞菌BF SCLM水平层面图(距PVC18 μm)图4经CAM处理8 h后成熟铜绿假单胞菌BF表面SCLM图像图5成熟铜绿假单胞菌BF经CAM处理36 h后SCLM图像图6经CAM处理成熟铜绿假单胞菌BF 24 h后其培养液涂片的SCLM图像基金项目：卫生部重症监护室获得性肺炎预防技术系列研究基金资助(43)

参考文献1，Kondoh K,Hashiba M,Baba S.Inhibitory activity of clarithromycin on biofilm synthesis with pseudomonas aeruginosa.Acta Otolaryngol，1996,525 Suppl:56-60.2，方向群，刘又宁，陈迁，等.阿奇霉素对生物被膜的抑制及对氟罗沙星的增效作用.中华结核和呼吸杂志，1998，21：538-540.3，Nichols WW,Evans M,Slack ME,et al.The penetration of antibiotics into aggreates of mucoid and non-mucoid pseudomonas aeruginosa.J Gen Microbiol，1989,135:1291-1303.4，Brown ML,Aldrich HC,Gauthier JJ.Relationship between glycocalyx and povidone-iodine resistance in pseudomonas aeruginosa (ATCC27853)biofilms.Appl Environ Microbiol，1995,61:187-193.5，Prosser BT,Taylor D,Dix BA,et al.Method of evaluating effects of antibiotics on bacterial biofilm.Antimicrob Agents Chemother，1987,31:1502.

(收稿日期：1999-06-24)