关键词： 肿瘤坏死因子；气道上皮细胞；核因子κB；地塞米松

【摘要】目的探讨前炎因子肿瘤坏死因子（TNF-α）对气道上皮细胞核因子κB的激活情况及糖皮质激素对核因子κB的影响。方法在人气道上皮细胞株（16HBE）加入不同浓度的TNF-α及地塞米松，于不同时间提取RNA和细胞核蛋白，利用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和电泳迁移率实验检测白细胞介素8（IL-8） mRNA和核因子κB的表达。结果核因子κB活性表达水平在TNF-α刺激后1小时明显增加，2小时达到高峰（143±11），与对照组（64±10）比较差异有显著性（P＜ 0.05），4小时时下降。随着TNF-α量的增加，核因子κB活性水平也随之升高,同时IL-8 mRNA表达明显升高（0.48±0.03）。加入地塞米松后核因子κB活性水平和IL-8 mRNA的表达均降低(126.38±2.55；0.34±0.05)。亚单位p50和p65抗体均参与核因子κB的组成。结论TNF-a激活人气道上皮细胞核因子κB，进而通过调节IL-8的表达参与炎症进程，糖皮质激素通过抑制核因子κB的激活而发挥抗炎的作用。

Proinflammatory cytokine stimulated NF-κB activation and the effect of dexamethasone in the human airway epithelial cells

ZHANG Yanhong, XU Jun, ZHONG Nanshan.

Department of Pulmonary Medicine ,Guangzhou Institute of Respiratory Diseases, Guangzhou 510120, China

【Abstract】ObjectiveTo observe the expression of NF-κB activation and the effect of dexamethasone on the NF-κB activity in the human airway epithelial cell line 16HBE after TNF-α stimulation.MethodsAfter 16HBE was treated with different concentration of TNF-α（10 U/ml，100 U/ml，1 000 U/ml）and dexamethasone（100 nmol/L）, total RNA and cellular nuclear protein were extracted at 1 hour,2 hour,4 hour ,respectively. RT-PCR and electrophoresis mobility shift assay(EMSA) were used to detect the expression of IL-8 mRNA and NF-κB activation.ResultsThe activity of NF-κB activation became stronger at 1 hour in the TNF-α stimulated group than the control, peaked at 2 hours and then decreased at 4 hours. Supershift assay confirmed that both p50 and p65 were components of active NF-κB. At the same time, IL-8 mRNA expression was elevated at 4 hours. After dexamethasone treatment,the expression of NF-κB activation and IL-8 mRNA became lower.ConclusionsIt is suggested that activated NF-κB played a key role in the inflammatory process of respiratory diseases through regulating the expression of some important factors (cytokines). Glucocorticoid inhibited the activation of NF-κB and showed antiinflammatory effect.

【Key words】TNF-α；NF-κB；Dexamethasone；Airway epithelial cell

核因子κB（NF-κB）为多种重要炎前因子的转录激活因子，通过在表达过程中最重要的环节转录水平的调控来发挥其重要功能^［1,2］。肿瘤坏死因子（TNF-α）是一个重要的一线细胞因子，在气道炎症的发生发展中起着关键的作用。研究报道TNF-α刺激细胞使NF-κB激活^［3］，从而上调细胞因子的表达，糖皮质激素对NF-κB的激活有抑制作用^［4］。我们的实验利用体外培养的人气道上皮细胞株16HBE，检测在不同情况下NF-κB的激活以及白细胞介素8(IL-8)的表达，试图探讨激活的NF-κB在气道上皮细胞的作用和糖皮质激素的可能抗炎作用机制。

材料与方法

一、人气道上皮细胞株的培养

人气道上皮细胞株16HBE由英国南安普顿大学惠赠，在含10%胎牛血清MEM细胞培养基中进行培养，待细胞长满70%～80%时加入不同浓度（10 U/ml，100 U/ml，1 000 U/ml）的TNF-α（美国R & D公司）刺激2小时；或在一定浓度的TNF-α（1 000 U/ml）下刺激1、2、4小时；地塞米松(100×10^-9mol/L, 美国Sigma公司)与TNF-α（1 000 U/ml）一起刺激细胞2小时；分别搜集细胞以提取细胞核蛋白。TNF-α（1 000 U/ml）单独或与地塞米松(100×10^-9mol/L)一起刺激细胞4小时后进行RNA的提取。每个实验点为一组重复3次。RNA提取及逆转录试剂，电泳迁移率实验试剂，Taq酶均购于美国Promega公司, 抗p65抗体及抗p50抗体均购于美国Santa cruz biotechnology公司。测蛋白浓度试剂购自美国BioRad公司。

二、RT-PCR

RNA的提取采取热酚一步法^［5］，取1 μg总RNA，采用Oligo（dT）₁₅引物及逆转录酶在20 μl体积下，42℃ ，15分钟逆转录反应后，进行聚合酶链式反应。IL-8引物自行设计，β-actin引物根据文献［6］在上海生物工程公司合成：IL-8引物 ：上游5′-AGT GCT AAA GAA CTT AGA TG-3′，下游5′-TAT GAA TTC TCA GCC CTC TT-3′，β-actin引物：上游5′-ATG TGG CAC CAC ACC TTC TAC AAT GAG CTG CG -3′，下游5′-CGT CAT ACT CCT GCT TGC TGA TCC ACA TCT GC-3′。反应条件：94℃ 1分钟，54℃ 1分钟，72℃ 2分钟，72℃延伸10分钟，共28个循环。IL-8、β-actin扩增产物分别为218 bp，831 bp。经1%琼脂糖电泳后利用凝胶分析系统（英国UVP公司）对扩增产物条带进行扫描，记录光密度值，以IL-8/β-actin的比值作为IL-8 mRNA表达的相对含量。

三、细胞核蛋白的提取

细胞核蛋白的提取参照文献进行^［7］。收集细胞（细胞数为1×10⁷个），经低温，低渗及破坏细胞膜（核膜）试剂处理细胞后，高速离心，取含核蛋白的上清分装保存于-70℃备用。以牛血清白蛋白制作标准曲线，Bradford法测蛋白浓度。

四、电泳迁移率实验

标记双链探针序列如下：5′-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3′应用［γ-³²P］ATP(北京亚辉公司)标记，在T₄多核苷酸激酶作用下进行，聚丙烯酰胺凝胶纯化后与适量核蛋白（10 μg）进行结合反应，经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳3小时（在125V电压下进行），80℃干胶后于-70℃下进行放射自显影，显影后利用凝胶分析系统进行密度扫描，以扫描值作为NF-κB活性水平。超迁移率实验：于加入探针前先加入抗体(适当量4℃下孵育30分钟)；特异性竞争实验在加入探针前先加入未标记的探针，其他步骤相同。

五、统计学处理

数据用±s表示，各组间比较利用方差分析和q检验，以P＜0.05为有差异有显著性。

结果

一、TNF-α刺激气道上皮细胞激活NF-κB

1 阴性对照组(不加核蛋白)；2 培养基对照组(不加TNF-α)；3 TNF-α与地塞米松共处理组；4 tNF-α刺激组

图1TNF-α刺激16HBE细胞激活NF-κB(2 h)及地塞米松的抑制作用

TNF-α刺激气道上皮细胞后可以激活NF-κB，在培养基的培养条件下有一定水平的表达（64±10，图1）。动态观察NF-κB变化情况，TNF-α刺激后2小时 (143±11) 为最高，4小时已有所下降,各实验组与对照组比较差异均有显著性（P＜0.05）。随着TNF-α量的增加，NF-κB活性也随之升高，与对照组比较差异均有显著性（P＜0.05，图2）。进一步超迁移率实验发现，p50和p65抗体均参与激活的NF-κB的组成（图3）。

1，5均为培养基对照组(不加TNF-α孵育2 h组)；2～4分别为1、2、4 h组(1 000 U/ml，TNF-α)，6～8分别为10 U/ml、100 U/ml、1 000 U/ml TNF-α刺激组(2 h)

图2在不同TNF-α浓度或刺激时间下处理16HBE细胞后NF-κB活性的动态变化

1阳性对照组；21+未标记探针(特异性竞争实验)；31+抗p50抗体；41+抗p65抗体；5阴性对照(未加核蛋白)

图3超迁移率实验

二、TNF-α刺激气道上皮细胞IL-8表达增高

RT-PCR发现TNF-α刺激气道上皮细胞4小时IL-8 mRNA表达增高（1.06±0.07），与对照组（0.75±0.06）比较差异有显著性（P＜0.05，图4）。说明TNF-α刺激气道上皮细胞引起IL-8 mRNA表达增高。

1 对照组；2 TNF-α刺激组；3 tNF-α+地塞米松组；4 Marker(100、200、300、400