关键词： 哮喘；β₂肾上腺素能受体；基因多态性

摘要：目的：探讨中国北方汉族人群β₂肾上腺素能受体（β₂AR）16、27和164位点基因多态性与支气管哮喘的相关性。方法：采用等位基因特异性聚合酶链反应（PCR）方法，对58例哮喘缓解期患者进行β₂ AR基因多态性分析检测,并与89名正常者进行对照。结果：(1)中国北方汉族人群β₂ AR基因16、27、164位点多态性分布频率与英美高加索人群不同；(2)哮喘组人群β₂ AR基因16位点多态性分布频率显示，精氨酸/精氨酸基因型占24%，精氨酸/甘氨酸基因型占45%，甘氨酸/甘氨酸基因型占31%，后者与正常对照组比较，比数比（OR）为4.0，95% 可信限（CI）为1.7～9.7，差异有显著性(P＜0.01)，而等位基因频率与正常对照组比较，差异无显著性(P＞0.05)。另外结果还显示，β₂ AR基因16位点多态性与哮喘病情严重程度有关联，甘氨酸/甘氨酸基因型在重度哮喘组中所占比与轻度哮喘组和中度哮喘组比较，差异有显著性（P＜0.05）。结论：我国北方汉族人群中β₂ AR基因16位点多态性与支气管哮喘相关联。

Study on β₂ adrenergic receptor genetic polymorphisms in asthmatics in the people of the Han nationality of northern China

GAO Guangkai, WANG Shiwen, ZHANG Jinchuan.

（Department of Geriatric Respiratory Disease, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853，China）

Abstract：Objective：To analyze the association between β₂ -AR genetic polymorphism and asthma in the people of the Han nationality of northern China.Methods：Allele Specific-PCR techniques were used to determine 16、27 and 164 locus alleles of β₂-AR genetic polymorphisms in 58 unrelated patients with asthma and 89 healthy controls from the people of the Han nationality of northern China.Results：(1) The distribution frequency of genotype β₂-AR 16 loci:Arg/Arg genotype accounts for 13%, Arg/Gly 76% and Gly/Gly 11%. The β₂-AR 27 loci:Gln/Gln genotype accounts for 36%,Gln/Glu 55% and Glu/Glu 9%.The β₂-AR 164 loci:Thr/Thr genotype accounts for 30%,Thr/Ile 53% and Ile/Ile 17%. (2)The frequency of genotype β₂-AR 16 loci in asthmatics: Arg/Arg genotype accounts for 24%, Arg/Gly 45% and Gly/Gly 31%. There was a significant increase in the frequency of Gly/Gly genotype in asthmatics compared with healthy group(OR=4.0,95% CI 1.7～9.7),but there was no significant difference in the allele frequency of asthmatics compared with healthy group. The frequency of genotype β₂-AR 27 loci in asthmatics: Gln/Gln genotype accounts for 34%, Gln/Glu 56% and Glu/Glu 10%. There was no significant difference in the allele frequency of asthmatics compared with healthy group. The frequency of genotype β₂-AR 164 loci in asthmatics: Thr/Thr genotype accounts for 10%,Thr/Ile 83% and Ile/Ile 7%. There was no significant difference in the frequency of Ile/Ile genotype in asthmatics compared with healthy group, and in the allele frequency of asthmatics compared with healthy group. In addition , our study reveals that β₂-AR 16 locus genetic polymorphism is in association with asthmatic severity.Conclusions：These results suggest that β₂-AR 16 locus genetic polymorphism is correlated with asthma severity in the people of the Han nationality of northern China.

Key words：Asthma；β₂-adrenergic receptor；Genetic polymorphism

近年来，有关哮喘遗传学的研究引起各国学者的重视，研究表明，可能存在多种哮喘的易感基因，5q31区域即是哮喘易感基因研究的热点^［1，2］。目前尚未见中国北方汉族人群β₂肾上腺素能受体（β₂ AR）基因多态性与哮喘关联的研究报告。我们的研究以中国北方汉族正常人和哮喘患者为研究对象，应用现代分子生物学方法，对目前已知的三个可能涉及哮喘发病的β₂AR 16、27和164位点基因多态性进行分析检测，旨在了解β₂AR这3种基因多态性与中国北方汉族人群哮喘的关联情况，从分子水平探索遗传因素在中国北方汉族哮喘发病中的作用。

对象与方法

一、研究对象

选择门诊或住院哮喘缓解期患者58例，男41例，女17例，年龄4～56岁,全部符合中华医学会1997年支气管哮喘防治指南诊断标准^［3］，均为典型或确诊的病例，并根据临床特点和所需药物情况将患者分为间歇发作（0例）、轻度（26例）、中度（19例）和重度（13例）。健康成年人89名,男66名，女23名，年龄18～53岁，作为正常对照组。所有观察对象均为北方汉族。

二、引物合成

检测16位点精氨酸等位基因引物序列：上游 5′-CTT,CTT,GCT,GGC,ACC,CAA,TA-3′；下游 5′-ACA,ATC,CAC,ACC,ATC,AGA,AT-3′；16位点甘氨酸等位基因引物序列：上游 5′-CTT,CTT,GCT,GGC,ACC,CAA,TG-3′；下游 5′-ACA,ATC,CAC,ACC,ATC,AGA,AT-3′；聚合酶链反应（PCR）产物475 bp；27位点谷氨酰胺等位基因引物序列：上游5′-GGA,CCA,CGA,CGT,CAC,GCA,GC-3′；下游 5′-ACA,ATC,CAC,ACC,ATC,AGA,AT-3′；27位点谷氨酸等位基因引物序列：上游5′-GGA,CCA,CGA,CGT,CAC,GCA,GC-3′；下游 5′-下游 ACA,ATC,CAC,ACC,ATC,AGA,AT -3′；PCR产物442 bp；164位点苏氨酸等位基因引物序列：上游5′- TGG,ATT,GTG,TCA,GGC,CTT,AT-3′；下游 5′-CAC,AGC,AGT,TTA,TTT,TCT,TT-3′； 164位点异亮氨酸等位基因引物序列：上游5′- TGG,ATT,GTG,TCA,GGC,CTT,AT-3′；下游 5′-CAC,AGC,AGT,TTA,TTT,TCT,TT-3′；PCR产物662 bp。以上引物均由中国科学院微生物研究所基因工程中心Beckman Oligo DNA合成仪合成。

三、主要试剂和设备

脱氧核苷三磷酸（dNTP）为美国Promega公司产品。Taq DNA 聚合酶为美国Promega公司产品。饱和酚，蛋白酶K等均购自北京原平生物技术公司。PCR扩增仪为美国Perkin Elmer Gene Amp PCR System 2400产品；紫外分光光度仪为日本岛津Shimazu UV-600；Biofuge 22R型高速冷冻台式离心机为德国Heraeus公司产品。

四、实验方法

1.外周血DNA提取：取已二胺四乙酸(EDTA)抗凝的空腹静脉血5 ml,-20℃冻藏保存,采用酚、氯仿、异戊醇抽提DNA。取10 μl溶解液分别于260 nm和280 nm波长测A值(曾称光密度OD),计算含量和纯度。

2.PCR扩增:在0.2 ml薄壁反应管中加入10倍稀释之PCR缓冲液2.5 μl，4倍稀释之dNTP 2 μl，上游引物0.5 μl，下游引物0.5 μl，模板DNA 0.5 μl，MgCl₂ 2 μl，去离子H₂O 16 μl。短暂离心混匀后，于95℃加热反应混合液3 min，立即放入冰浴中，每管各加1 U Taq DNA聚合酶。10 000 r/min离心10 s混匀，将反应管置PCR扩增仪上，94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，共30个循环，最后72℃延伸5 min，自动降至4℃保存。取5 μl上述PCR扩增液与1 μl溴酚兰混匀后，加入预先铺好的含溴化乙靛(EB）的1.5% 琼脂糖凝胶样品孔内，50 V电泳60 min，取下凝胶，在300 nm紫外灯下观察结果(图1～3)。

M为标志物；2，3泳道为精氨酸/甘氨酸杂合子；

4，5泳道为精氨酸纯合子；6，7泳道为甘氨酸纯合子

1β₂AR 16位点基因多态性电泳结果

M为标志物；2，3泳道为谷氨酰胺/谷氨酸杂合子；

4，5泳道为谷氨酰胺纯合子；6，7泳道为谷氨酸纯合子

2β₂AR 27位点基因多态性电泳结果

M为标志物；2，3泳道为苏氨酸/异亮氨酸杂合子；

4，5泳道为苏氨酸纯合子；6，7泳道为异亮氨酸纯合子

3β₂AR 164位点基因多态性电泳结果

五、统计学处理

统计学处理均采用SAS数理统计软件包进行。先统计计算各比较组各位点基因型分布频率及等位基因频率，确认其符合Hardy-Weinberg平衡。组间频率比较用χ²