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材料与方法(1)肺泡巨噬细胞的分离和培养:以吸烟者12人，男10人，女2人(吸烟均大于200年支，近3 d仍吸烟)，非吸烟者12人，男8人，女4人为研究对象,被测对象均为健康者，并知情同意。行纤维支气管镜肺泡灌洗，灌洗液回收率60%～70%。置5% CO2孵箱中培养24 h。制成细胞悬液1×106个/ml备用。(2)细胞存活率计数:采用台盼蓝染色法。(3)细胞凋亡观察:①荧光染色观察:取细胞悬液95 μl和荧光染色液5 μl，混匀，37℃静置5 min，荧光显微镜下观察。②流式细胞仪观察:取细胞混悬液0.9 ml加纯乙醇2.1 ml混匀，4℃保存，PI法染色，上机观察。③DNA琼脂糖凝胶电泳:取1×106细胞悬液，按常规法提取DNA，琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察DNA梯状带并照相。(4)巨噬细胞RNA提取及RT-PCR bcl-2、mRNA表达测定:①总RNA提取及检测:采用TRI201试剂提取细胞总RNA法。②RT-PCR测定:采用RT-PCR法测定bcl-2 mRNA表达，具体引物由北京赛百盛医用生物工程公司合成。PCR具体步骤略。取产物10 μl用含溴化乙啶2％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果并拍照。统计学处理：试验数据以±s表示，组间差异采用χ2检验。
结果⑴吸烟组细胞存活率为（76.3±2.5）%，非吸烟组为(55.4±1.6)%(P＜0.01）。⑵细胞凋亡观察结果：①荧光染色观察:吸烟组凋亡细胞率为(38.6±4.5)%，不吸烟组凋亡细胞率为(59.4±5.1)%（P＜0.05）。⑵流式细胞仪观察:凋亡细胞在DNA直方图上可见G1峰前出现亚二倍体峰，分析凋亡细胞百分数，吸烟组为(19.2±1.4)%，不吸烟组为(33.4±1.0)% (P＜0.01)。⑶DNA琼脂糖凝胶电泳:不吸烟组肺泡巨噬细胞DNA可见较明显的“阶梯状条带”,吸烟组则未出现此条带。⑶巨噬细胞RNA提取及RT-PCR bcl-2 cDNA表达测定结果:总RNA电泳后可见28S、18S醒带。吸烟组出现bcl-2条带(386 bp)(n=12/12)、不吸烟组未出现bcl-2条带(n=0/12),两组bcl-2的表达相差显著（P＜0.01)。
讨论细胞凋亡在生理情况下,保证了生物体的正常发生、发展及其生命过程的顺利进行;在病理情况下，它是细胞群体平衡失调,导致一些疾病发生的重要原因。国外研究表明:bcl-2家族对细胞的凋亡起调控作用［1］。本实验结果提示:吸烟者肺泡巨噬细胞增多与细胞凋亡减少有关。烟雾中的某些成份，通过促进bcl-2表达，使巨噬细胞的凋亡抑制，肺泡巨噬细胞的增多，而肺泡巨噬细胞的增多在肺气肿的形成和发展中有重要意义。
基金项目：国家自然科学基金项目（39700066）
参考文献：
1O'Connor R.Survival factors and apoptosis.Adv Biochem Eng Biotechnol.1998，62:137-166.
收稿日期：1999-07-30
