关键词： 一氧化氮； 哮喘；气道高反应性

【摘要】目的利用一氧化氮合成前体L-精氨酸（L-Arg）和一氧化氮合酶抑制剂亚硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）研究内源性一氧化氮在哮喘大鼠气道高反应性中的作用，探讨支气管哮喘的发病机制。方法用卵白蛋白作为致敏原制备哮喘大鼠模型，建立大鼠离体气管环张力的测定方法，并用L-Arg、L-NAME和L-Arg+L-NAME孵育离体气管环，观察气管环乙酰胆碱浓度反应曲线和最大收缩反应的变化，同时观察去上皮对哮喘大鼠气道反应性的影响。结果哮喘大鼠（10只）离体气管环经L-NAME10^-5 mol /L孵育后对乙酰胆碱的最大收缩反应从孵育前(124±39) mg上升到(187±53) mg，孵育前、后最大收缩反应比较差异具有显著性（P＜0.01），浓度反应曲线上移，而L-Arg可以逆转L-NAME的作用，单用L-Arg2×10^-5 mol/L和L-Arg 10^-3 mol/L孵育气管环，对哮喘大鼠气管环的最大收缩反应和浓度反应曲线与对照组比较，差异无显著性(P＞0.05)。去上皮哮喘大鼠气管环的反应性与上皮完整气管环比较差异有显著性（P＜0.005），而L-Arg、L-NAME＋L-Arg和L-NAME孵育去上皮气管环对其反应性均无显著性(P＞0.05)。结论内源性一氧化氮在哮喘大鼠气道高反应性中起重要作用，并参与哮喘的发病。

The role of endogenous nitric oxide in airway hyperresponsiveness of asthmatic rats

HUANG Tiequn, LIN yaoguang, ZHU Yuanjue, et al.

department of Respiratory Diseases, Peking Hospital, Chinese Academy of Medical science and Peking Union Medical College, Beijing 100730

【Abstract】ObjectiveNitric oxide (NO) precursor L-arginine (L-Arg) and NOS inhibitor NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) were used to investigate the role of endogenous NO in airway hyperresponsiveness of asthmatic rats. MethodsAsthmatic wistar rats were developed by sensitization and challenging with ovalbumin. airway responsivess to acetylcholine (Ach) was measured in vitro in isolated and perfused rat tracheal rings with or without epithelium after inhibiting or stimulating NO synthesis. ResultsAfter asthmatic rat tracheal rings were incubated in vitro with L-NAME 10^-5 mol/L, the maximal response of tracheal rings to Ach was increased compared with that of the control group. When asthmatic rat tracheal rings were coincubated with L-Arginine2×10^-5 mol/L and L-NAME 10^-5 mol/L, the maximal response was decreased compared with that of the L-NAME group. Incubation with higher concentrations of L-Arginine did not change asthmatic rat tracheal responsiveness to Ach. Epithelium-denuded tracheal rings in the asthmatic rats showed a significant (P＜0.05) upward shift in the Ach concentration response curve; the maximal response was increased compared with the tracheal intact group. In the denuded tracheal rings, L-NAME and L-Arginine did not influence the shape of the Ach concentration-response curve and the maximal response. conclusiosnsEndogenous nitric oxide, a mediator of bronchodilation, is synthesized from L-Arginine by NO synthase in asthmatic rats. The epithelium lining airway smooth muscle probably contributes to nitric oxide synthesis. Our finding suggests that the airway in asthmatic rats could not use exogenous L-Arginine to synthesize nitric oxide.

【Key words】Nitric oxideAirway hyperresponsivenessAsthma

自从1987年证实一氧化氮（NO）是内皮源舒张因子的主要活性成分以来，对于一氧化氮在心血管系统中的生理功能及在某些疾病发病中的作用进行了广泛的研究。而对于非血管平滑肌如气道平滑肌方面的作用，特别是某些呼吸系统疾病发病中的作用如支气管哮喘也引起极大兴趣。Nijkamp等^［1］用一氧化氮合酶抑制剂（L-NAME）给正常豚鼠吸入和体外灌流气管条可以使正常豚鼠气道反应性增高。我们观察一氧化氮抑制剂亚硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）对哮喘大鼠气管环张力的影响以及L-精氨酸的调节作用。

材料与方法

一、大鼠哮喘模型的建立

实验用健康雄性wistar大鼠20只，体重200～250 g，随机分成两组。正常对照组（10只）：第1天用生理盐水2 ml腹腔注射，于15天用蒸馏水雾化吸入，每天30分钟，共7天。哮喘组（10只）：第1天每只大鼠用卵白蛋白10 mg加氢氧化铝干粉200 mg与灭活百日咳菌苗5×10⁹个配成2 ml混悬液腹腔注射，于第15天开始用1％卵白蛋白超声雾化吸入，每天1次，每次30分钟，共7天。在制备气管环同时，取大鼠右肺中叶，常规切片HE染色，光镜检查以证实模型。

二、大鼠气管环的制备及张力测定

所有Wistar大鼠用戊巴比妥钠按40 mg/kg体重用量腹腔注射麻醉，打开胸腔，分离气管，仔细分离避免损伤气管，将气管连同心肺取出，放入克亨（Krebs）液中，在主气管中段10个软骨环长的气管，沿气管环之间由前向后和由后向前交叉以剪刀横向剪开，做成气管连环，用细钢丝做成钩，穿入气管连环上端固定在浴槽底部的钩上。浴槽的大小为10 ml，放入Krebs液其成份为: Nacl 118.1 mmo/L、Kcl 4.7 mmol/L,CaCl₂2.5 mmol/L,MgSO₄·7 H₂O 1.2 mmol/L,NaHCO₃ 25 mmol/L,KH₂PO₄ 1.2 mmol/L、葡萄糖11.1 mmol/L、pH 7.40,浴槽内通入95％氧加5％二氧化碳混合气，槽内温度由恒温器蠕动泵以2 l/min流率推动水循环使槽内温度维持在37℃。

三、实验方法

气管环分组：将气管环分为正常对照组（n=10）及哮喘组（n=10），哮喘组为激发后的大鼠。然后再将哮喘组分为上皮完整组（n=10）和去上皮组(n=7)，去上皮的方法为用一根小粗糙的棉花棒穿人气管腔，轻轻滚动3次，为了证明去上皮，去上皮气管留作组织学检查。

气管环挂在浴槽底部并连接张力传感器之后，调节静息张力为2 g平衡60分钟，每15分钟更换Krebs液1次，平衡完毕后用氯化乙酰胆碱以递增的方式加入浴槽内，每个浓度间隔5分钟，使其终浓度依次达到10^-8mol/L、10^-7mol/L、10^-6mol/L、10^-5mol/L、10^-4 mol/L，记录气管环的收缩反应，终浓度是通过预试验及参考文献［1］而得出，根据定标测定张力值。用Krebs液冲洗3次，洗去浴槽中的试剂，平衡后加入L-NAME10^-5mol/L浓度孵育30分钟，加入乙酰胆碱达到终浓度为10^-8mol/L、10^-7mol/L、10^-6mol/L、10^-5mol/L、10^-4 mol/L，记录张力的变化，再用Krebs液冲洗3次，平衡后依上述步骤分别加入L-NAME10^-5mol/L+L-Arg 2×10^-5 mol/L及单纯L-Arg 2×10^-5 mol/L和L-Arg 10^-3mol/L,并分别测定张力的变化。

4.仪器与试剂：张力传感器及打印记录仪为北京航天医学工程研究所出品，自动平衡记录仪为上海大华仪表厂产品，501型超级恒温器为重庆试验设备厂制造，95％氧及5％二氧化碳混合气购于北京氧气厂。氯化乙酰胆碱（Ach）、L-NAME、L-Arg、卵白蛋白均为美国Sigma公司产品、百日咳菌苗购于北京生物制品研究所。

5.统计学分析：数据以±s表示,同组数据均用方差分析进行均数差异显著性检验，不同试验组用t检验进行均数差异显著性检验。P＜0.05为差异有显著性。

结果

一、哮喘大鼠气管环对乙酰胆碱的反应

用相同浓度的乙酰胆碱加入气管环的浴槽中正常大鼠组（n=10）和哮喘组（n=10）气管环分别升高为（35±18）mg和（124±39）mg，哮喘组气管环对乙酰胆碱的反应性明显高于正常对照组（P＜0.05）。

二、L-NAME对哮喘大鼠气管环乙酰胆碱收缩反应的作用

哮喘组大鼠气管环(n=10)用L-NAME 10^-5mol/L孵育30分钟，再用乙酰胆碱刺激，最大收缩反应从未用L-NAME的（124±39） mg上升到（187±53） mg，呈明显增加（P＜0.01），乙酰胆碱浓度反应曲线亦明显上移。

三、L-Arg对L-NAME作用的影响

用L-Arg 2×10^-5 mol/L和L-NAME 10^-5 mol/L一起孵育哮喘大鼠离体气管环（n=10）30分钟，气管环最大收缩反应为（126±41）mg,较单用L-NAME孵育组明显下降（P＜0.05）,与未用药的对照组比较差异无显著性，其浓度反应曲线亦接近对照组。

四、L-Arg对哮喘大鼠气管环反应性的作用

用L-Arg 2×10^-