关键词： 分支杆菌；结核；抗原，16 000蛋白；基因表达；免疫学特性

【摘要】目的获得高效表达结核分支杆菌16 000抗原的大肠杆菌工程菌，将培养物纯化后得到重组16 000蛋白抗原纯品，并检测其免疫学特性。方法用聚合酶链反应(PCR)方法获得目的基因构建大肠杆菌高效表达株。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析重组蛋白抗原的相对分子质量大小及表达形式。DEAE及PEI凝胶纯化重组蛋白。Western印迹及酶联免疫吸附测定法(ELISA)分析重组蛋白的免疫原性。结果构建了具有正确基因序列的重组表达载体，在大肠杆菌BL₂₁(DE₃)中诱导表达，重组蛋白占菌体总蛋白的40%，Western印迹结果证实该重组蛋白能与抗结核分支杆菌多克隆抗体发生特异免疫结合反应。ELISA分析中，该纯化的重组抗原能区别抗结核抗体阳性患者血清及正常人血清。结论实验中获得了能高效表达16 000蛋白抗原的大肠杆菌工程菌，以可溶性形式存于胞浆内。该重组蛋白具有特异的免疫原性。

High-level expression of Mycobacterium tuberculosis 16 000 antigen in E.coli

XIONG Zhihong, ZHUANG Yuhui, ZHANG Xiaogang,et al.

Tuberculosis Research Laboratory,The 309th Hospital of PLA, Beijing 100091

【Abstract】ObjectiveTo gain the recombinant protein antigen 16 000 of Mycobacterium tuberculosis highly expressed in E.coli &127;and study its immunological characteristics.MethodsDNA fragments code for the protein were obtained by PCR, then cloned into the pET plasmid vector to gain recombinant E.coli. Cells were cultured and induced to produce recombinant protein, whose molecular size and present form were analyzed by SDS-PAGE,and its immunological characteristics were analyzed by Western-blotting and ELISA technology.ResultsThe clone was analyzed at the nucleotide lever and shown the same DNA sequence coding for natural 16 000 protein.Analyzed by SDS-PAGE and Western-blotting,it was found to produce immunoreactive proteins with mobilities very similar to those of the 16 000 protein antigen,and the recombinant protein amounted to 40% of total cell proteins.ELISA results indicated that the purified recombinant protein could distinguish sera from tuberculosis patients with anti-PPD antibody and those from tuberculin positive contacts.ConclusionsRecombinant 16 000 protein antigen highly expressed in the form of solution in E.coli was gained and this antigen was located in cell plasma. This recombinant protein showed specific immunogenicity.

【Key words】Mycobacterium tuberculosisAntigen, 16 000 proteinGene expressionImmunological characteristics

结核病仍为危害全球健康的主要疾病之一，为了改进目前诊断试剂的特异性和研究筛选有价值的亚单位基因工程菌苗，近年来人们对其致病菌的基因及相关蛋白质进行更深入的研究，以期寻找到有应用价值的特异性蛋白质或相关基因,有目的地利用基因工程技术获得重组蛋白抗原为以上研究提供极大的便利。

使用结核分支杆菌单克隆抗体TB68筛选出来的16 000蛋白抗原^［1］，为结核分支杆菌主要的膜蛋白^［2］，对其天然提取物的研究结果表明，该蛋白不仅携带有结核分支杆菌特异性的B细胞表位^［3］，并能诱导细胞介导的免疫应答反应^［4］，具有潜在的诊断应用价值^［5］。大量获得重组16 000蛋白抗原就为更深入研究该蛋白的生物学、免疫学活性，开发其应用价值提供便利。

我们报道了结核分支杆菌16 000蛋白抗原编码基因在大肠杆菌中的克隆、高效表达及其产物的纯化与产物的免疫学鉴定。

材料与方法

一、材料

1.质粒与菌株：大肠杆菌宿主菌JM109、BL₂₁(DE₃)为本室保存，质粒pET为清华大学提供。

2.酶与试剂：Vent-DNA聚合酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶Ncol、BamHI等均购自New England Biolabs公司，用于纯化DNA的回收试剂盒购自北京宝泰克公司。辣根过氧化物酶(HRP)酶标兔抗羊IgG、羊抗结核分支杆菌多克隆抗体、HRP酶标兔抗人IgG均为本室制备及保存,钓取基因的一对引物由上海生物工程公司合成，重组质粒上目的基因的序列测定由赛百胜公司完成。

3.血清来源：结核患者血清由本院结核科提供，肺结核经临床表现、体征、胸部X线及细菌学检查确诊，且经酶联免疫吸附试验(ELISA)抗结核分支杆菌纯蛋白衍生物(PPD)抗体检测确定为抗结核抗体阳性血清。非结核患者血清由本院检验科提供。

二、方法

1.目的基因的获得：以结核分支杆菌基因组DNA为模板，加入适当的引物、dNTP及Vent-DNA聚合酶，于94℃ 60秒、55℃ 30秒、72℃ 90秒条件下，共30个循环，最后一循环中，72℃延伸10分钟。PCR产物使用回收试剂盒进行纯化。

2.表达载体的构建：参照Sambrook手册^［6］，用NCOI及BamHI酶切处理PCR产物及pET质粒，纯化后进行连接反应，转化大肠杆菌JM109后，采用质粒的快速抽提方法及酶切筛选鉴定重组子。

3.工程菌的诱导培养及产物的检测：将鉴定好的重组质粒纯化感受态细胞BL₂₁(DE₃），37℃培养，异丙基硫代-B-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达，收获菌体后加入SDS-加样缓冲夜，沸腾处理，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。使用羊抗结核分支杆菌多克隆抗体，Western印迹方法鉴定表达产物^［6］。

4.重组蛋白的纯化：收集诱导表达后的菌体，溶于50 mmol/L的咪唑盐酸(pH 6.5)溶液，超声波处理使菌体裂解，12 000×g 30分钟离心取上清，加样于平衡好的DEAE-52纤维素层析柱，使用0～0.3 mol/L NaCl梯度洗脱，收集含重组16 000蛋白管，用25 mmol/L Tris-醋酸透析后，上样于平衡好的PEI(NH)柱，1 mol/L醋酸钠洗脱，收集含重组16 000蛋白管。

5.ELISA检测纯化的重组蛋白的免疫特性：参考有关文献［7］，ELISA操作按常规方法进行。DG-3022型酶联检测仪测吸光度［A，曾称光密度(OD)］值。

结果

一、目的基因的获得

使用设计的一对引物，PCR方法从结核分支杆菌H₃₇R_V基因组DNA中获得特异性高的DNA片断，且大小与预计相符，约500 bp。

二、目的基因的克隆与鉴定

将目的基因片断与pET载体连接后，酶切鉴定及PCR鉴定均证实确有一大小为500 bp的片断插入载体，初步确认为正确的重组表达载体，命名为pET-16,见图1。

apET空质粒NcoⅠ/BamHI双酶切bpET空质粒PCR扩增鉴定cpET-16质粒NcoⅠ/BamHI双酶切dpET-16质粒上目的基因的PCR扩增鉴定eλDNA/HindⅢ酶切标志物

图1重组表达质粒pET-16的鉴定图谱

使用载体上T7启动为上游引物，测出该重组表达载体pET-16上插入的目的基因序列全长与Swiss Protein基因库中发表的序列一致。说明构建的基因序列无误,有正确蛋白质翻译阅读框架的重组子pET-16。

三、重组菌的诱导表达及产物的鉴定

将重组子pET-16纯化大肠杆菌BL₂₁(DE₃),培养过夜，IPTG诱导表达后，全菌体的SDS-PAGE结果表明：与对照菌pET/BL₂₁(DE₃)相比，pET-16/BL₂₁(DE₃)菌体在相对分子质量16 000位置附近有浓重的表达条带出现，表达的重组蛋白经激光密度扫描测定占菌体总蛋白的40%。对该表达菌体进行超声波破碎，重组蛋白均出现在破碎后的上清中,沉淀极少，且含表达条带也少，说明该重组蛋白主要以可溶性形式存于细胞胞浆中，见图2。Western印迹分析结果表明该条带能与羊抗结核分支杆菌多克隆抗体有高特异性免疫结合反应。

apET-16/BL₂₁(DE₃)表达菌超声破碎后上清bpET-16/BL₂₁(DE₃)表达菌超声破碎后沉淀cpET-16/BL₂₁(DE₃)表达菌全菌体d蛋白质中等分子标准epET/BL₂₁(DE₃)空载体对照菌体

图2重组蛋白表达菌体的SDS-PAGE分析

四、重组蛋白的纯化

将破碎后的上清经过DEAE-52纤维素柱后，得到重组16 000蛋白的