关键词： 哮喘；淋巴细胞；增殖；凋亡；抗CD+4人-鼠嵌合抗体

【摘要】目的观察抗CD⁺₄人-鼠嵌合抗体对哮喘发作期患者外周血淋巴细胞体外增殖及凋亡的作用。方法取哮喘患者外周血淋巴细胞,分别加入50 mg/L、100 mg/L抗CD⁺₄人-鼠嵌合抗体, 采用流式细胞仪及原位末端标记法观察其对经抗CD⁺₃单抗诱导的体外培养0、24、48小时淋巴细胞凋亡的影响,同时采用四甲基偶氮唑盐（MTT）微量比色法观察其对淋巴细胞增殖的影响。 结果哮喘患者淋巴细胞经抗CD^＋₃单抗诱导培养24小时(3.3±0.7)%及48小时（5.2±1.5)%凋亡细胞阳性率与正常人24小时(6.5±3.3)%、48小时（8.9±3.0）% 比较，差异有显著性（P＜0.05）； 淋巴细胞增殖反应(0.290±0.013)与正常组(0.220±0.015)比较差异有显著性（P＜0.05）；50 mg/L、100 mg/L抗CD^＋₄人-鼠嵌合抗体均可显著增加哮喘患者淋巴细胞凋亡数量［50 mg/L：24小时为（14.20±2.20）%，48小时为（33±4）% ;100 mg/L：24小时为（21±5）%,48小时为（40.0±2.7）%］，两者比较差异有显著性(P均＜0.01); 并明显抑制正常组［50 mg/L:（0.170±0.011）%;100 mg/L（0.140±0.012)%］及哮喘患者［50 mg/L：(0.265±0.010)%;100 mg/L：（0.238±0.020)］的淋巴细胞增殖反应(P均＜0.01),在哮喘患者中的作用呈剂量依赖性(r=0.642,P＜0.05),较大剂量者可使哮喘患者淋巴细胞的增殖接近于正常人的增殖水平。结论哮喘患者外周血淋巴细胞经抗CD⁺₃单抗诱导的增殖反应增高而凋亡减少,构建抗CD⁺₄人-鼠嵌合抗体，可通过抑制哮喘T细胞增殖,促进T细胞凋亡,发挥免疫调节作用。

Effects of anti-CD⁺₄ human/murine chimeric antibody on the proliferation and apoptosis of lymphocyte in patients with asthma

XUE Jianmin, XU Yongjian, ZHANG Zhenxiang

Department of Respiratory Disease, Tongji Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430030

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of anti-CD⁺₄ human/murine chimeric antibody on the proliferation and the apoptosis of peripheral blood lymphocytes (PBL) in patients with asthma. MethodsPBL isolated from patients with asthma were cultured with 50 mg/L、100 mg/L anti-CD⁺₄ human/murine chimeric antibody and anti-CD⁺₃ McAb (10 mg/L) for 0, 24, 48 h in vitro, the apoptosis cell percentage were detected by flow cytometry and in situ end-labeling technique of fragmental DNA as well as the proliferation of PBL were detected by MTT method. ResultsComparing with normal controls, the apoptosis cell percentage was significantly decreased by stimulation with anti-CD⁺₃ McAb for 24 h and 48 h, the proliferation of lymphocyte was increased in patients with asthma; the apoptosis cell percentage of patients with asthma was significantly increased (P＜0.01, respectively) with the cell cultured with 50 mg/L or 100 mg/L anti-CD⁺₄ human/murine chimeric antibody for 24 h or 48 h At the same time the lymphocyte proliferation was inhabited (P＜0.01,respectively). ConclusionsIt is demonstrated that the proliferation of PBL in patients with asthma were increased and the apoptosis cell percentage were decreased, anti-CD⁺₄ human/murine chimeric antibody had inhibited the proliferation of T lymphocyte and had enhanced the T lymphocyte apoptosis . The anti-CD⁺₄ human/murine chimeric antibody may be potentially useful for the biotherapy of asthma.

【Key words】AsthmaLymphocyteProliferationApoptosisAnti-CD⁺₄ human/murine chimeric antibody

近年研究证实，在支气管哮喘(哮喘)的气道慢性非特异性炎症中淋巴细胞尤其是T淋巴细胞活化起关键作用。其中CD⁺₄辅助T细胞2(Th₂)的激活为主要发病环节。因此,调节CD⁺₄淋巴细胞的数目及功能是治疗哮喘的有效途径之一。此外,炎性病变组织中浸润的淋巴细胞等炎性细胞的凋亡是炎症消散的关键, 对凋亡过程的促进亦成为治疗这类炎性病变的重要思路。抗CD⁺₄单抗已用于免疫抑制治疗,可改善类风湿关节炎等自身免疫性疾病的病情^［1］, 但国内有关其在哮喘中的研究尚少报道。我们的研究通过观察抗CD⁺₄人-鼠嵌合抗体对哮喘发作期患者外周血淋巴细胞在体外培养条件下，T淋巴细胞增殖反应及对淋巴细胞凋亡的影响, 探讨抗CD⁺₄人-鼠嵌合抗体对哮喘CD⁺₄阳性细胞作用的生物效应。

对象与方法

一、药品与试剂

抗CD⁺₄人-鼠嵌合抗体、抗人CD⁺₃单克隆抗体(anti-CD⁺₃ McAb) 由同济医科大学实验中心免疫室沈关心教授惠赠,四甲基偶氮唑盐(MTT)为美国Sigma产品,RPMI 1640培养粉为美国Gibco产品。原位末端标记法检测细胞凋亡试剂盒为德国Boehringermannheim公司产品, 流式细胞仪为美国Becton Dickinson产品。

二、研究对象

急性发作期哮喘组患者10例,男4例,女6例,年龄20～54岁,平均年龄35岁,均为本院门诊就诊患者，符合1997年全国哮喘会议诊断标准。健康对照组10名,男5名,女5名,年龄23～50岁,平均年龄32岁，均为本院健康献血员。

三、方法

1.外周血淋巴细胞的分离：无菌取静脉血10 ml, 肝素抗凝, 加等量葡萄糖磷酸盐缓冲剂(GKN)洗液稀释,以等体积置于淋巴细胞分离液上, 2 000 r/min，离心20分钟, 收集界面细胞,以GKN洗液洗涤3 次后，台盼蓝染色活细胞比＞95%。

2.外周血淋巴细胞培养及抗CD⁺₄人-鼠嵌合抗体对T淋巴细胞增殖反应的影响：将淋巴细胞用含10%胎牛血清(Fbs)的RPMI 1640调至细胞浓度1×10⁹/L,取10 μl接种于96孔培养板,每孔均加入终浓度为10 mg/L的抗CD⁺₃单抗作为T细胞增殖刺激剂, 然后分别加入0、50 mg/L, 100 mg/L的抗CD⁺₄人-鼠嵌合抗体, 同时设两复孔及用等体积RPMI 1640代替抗CD⁺₃单抗及嵌合抗体的对照孔,于5% CO₂、37℃培养箱内培养72小时,采用MTT比色微量分析法测定T细胞增殖反应。结果以吸光度(A值,曾称光密度OD)表示, 增殖反应净增殖值＝刺激值均值－自发增殖均值。

3.抗CD⁺₄人-鼠嵌合抗体对哮喘患者外周血淋巴细胞凋亡的影响：用含10%胎牛血清的RPMI 1640调整细胞浓度至1×10⁹/L,接种于24孔细胞培养板中,每孔1 ml,分别加入终浓度0、50 mg/L、100 mg/L抗CD⁺₄人-鼠嵌合抗体, 每孔加入抗CD⁺₃单抗10 mg/L 于37℃、5% CO₂培养箱中培养0(基线值)、24、48小时，培养细胞分别采用流式细胞仪及原位末端标记(TUNEL法)检测淋巴细胞发生凋亡情况。

4.流式细胞仪检测：收集不同细胞分别调至浓度为1×10⁹/L淋巴细胞悬液,用磷酸盐缓冲液(PBS,0.01 mol/L,pH 7.2)稀释,1 000 r/min，每次5分钟,共2次, 经核糖核酸（RNA）酶消化后, 加入含50 mg/L的碘化丙啶(PI)混合，4℃ 1小时,上流式细胞仪检测。

5.TUNEL法检测外周血淋巴细胞凋亡：细胞凋亡的典型表现是基因组DNA在内源性核酸内切酶的作用下降解成核小体片段。TUNEL法的原理是利用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的特性, 将生物素标记的尿嘧啶连接到单链或双链DNA片段的自由末端上,可较精确的定量检测细胞凋亡,具体实验步骤参照文献报道方法进行^［2］。光学显微镜下观察,每实验孔制备3张涂片,每张涂片随机选择5个视野,计数200个细胞,计算凋亡阳性细胞百分率,以3张涂片的均数作为结果。

图1凋亡信号阳性细胞碱性磷酸酶显色于胞核，细胞固缩TUNEL×400

图2抗CD⁺₄人-鼠嵌合体(50 mg/L)刺激哮喘患者淋巴细胞48小时凋亡细胞增加TUNEL×100

图3抗CD⁺₄人-鼠嵌合抗体(100 mg/L)刺激哮喘患者<