应用聚合酶链反应(PCR)技术诊断结核病虽然其灵敏、特异和快速的特点在多数报道中得到肯定，但实验报告中出现的“假阳性”和“假阴性”问题，引起临床医生对PCR结果的疑虑。现就PCR技术诊断结核病的可信性问题综述如下。

一、临床含义的评价

按照传统习惯，常规细菌学涂片和培养法虽阳性率各异，但临床已将“菌阳”作为诊断结核病的重要参考依据。但由于这些检测手段本身存在一些缺点，如涂片法特异性差，非结核分支杆菌(MOTT)或其他细菌、孢子等抗酸染色亦为阳性，且灵敏度低，每ml痰液中含5 000条以上才能检出。培养法虽有检出10条以上活菌/标本的灵敏度，但耗时3～8周。1985年Mullis创建了PCR技术。1989年法国学者Hance首先以PCR技术检测分支杆菌^［1］。1990年我国引进该项技术，从而扩大了常规细菌学诊断方法的范畴，开始了以分子生物学PCR技术检测结核分支杆菌的新阶段，并很快在临床实验室得到推广。由于PCR技术灵敏度高，可检测1～100 fg纯化结核分支杆菌DNA，约相当于1～20个结核分支杆菌^［2］，检出阳性率明显高于常规细菌学方法，所以临床意义的评价也应以新的观念从多方面加以分析。

1.从流行病学角度分析，肺结核患者是由于通过呼吸道吸入空气中含有结核分支杆菌的微滴核而受感染的。＞5 μm的微滴核可被气管内的柱状纤毛细胞阻挡并予以排出，＜5 μm的则可通过气管进入支气管、肺泡，但不一定发病。常规方法很难检测这些暂存的结核分支杆菌，而PCR方法的高灵敏度则可能把这些少量寄存菌划入了PCR方法检出范围，此时带菌者并无临床症状。由此而产生的“假阳性”结果必然给临床医生带来困惑。结核分支杆菌感染的“亚临床状态”即潜在感染的结核分支杆菌被PCR技术扩增呈阳性，是造成“假阳性”的因素之一。

2.肺结核患者除血行播散型外，常可在血液单个核细胞中扩增出结核分支杆菌DNA。李国利等^［3］报道66例肺结核患者血标本结核分支杆菌DNA阳性率为39.0%。张吉旺等^［4］报道95例肺结核患者单个核细胞内结核分支支菌DNA阳性率为85.0%。Schluger等^［5］报道8例肺结核患者单个核细胞结核分支杆菌DNA均为阳性。以往常规的涂片法和培养法很难从血中单个核细胞中检测出结核分支杆菌，故起初对类似的报道和结果感到疑惑。

除此而外，当结核分支杆菌侵入正常人体后，可被机体吞噬细胞吞噬，部分结核分支杆菌不被吞噬细胞杀灭，可暂存于吞噬细胞中。这些细菌很难以常规方法检出，而PCR技术可将血中吞噬细胞裂解并检出结核分支杆菌DNA。

3.肿瘤组织坏死时，隐性病灶中结核分支杆菌可被释放^［6］，或由于免疫抑制作用导致结核分支杆菌再染及结核病复发。当肿瘤患者结核分支杆菌DNA阳性时，临床医生往往认为是“假阳性”。

4.假阳性被认为是由于被检物(淋巴结)内有结核分支杆菌持续存在或死菌DNA残留，但并无结核病灶的存在^［7］。

5.结核分支杆菌的L型及其它变异等，用常规涂片和培养法很难检出，PCR技术同样可检测其DNA。

排除实验本身影响因素，临床对分子生物学水平检测结果应予以新的评价。任何一种诊断方法其灵敏度和特异性均不能达到100%，对采用PCR技术发现的结核分支杆菌潜在感染的“亚临床状态”或“带菌者”需结合临床表现、其它实验室检查、影像学检查等综合分析。另外定量PCR技术将有助于解决结核病的诊断和鉴别诊断，属临床和实验室共同研究的新课题。

二、实验影响因素

1.PCR技术存在问题：(1)标本处理及结核分支杆菌DNA的抽提：清除标本中粘蛋白和破坏多聚酶活性的干扰物质、裂解菌细胞使释放出在与引物3′端结合部位无断裂无切口的完整DNA是最理想的抽提方法。目前常用的方法有经典法^［8，9］，超声粉碎法^［10］，煮沸法^［11］，Triton X-100破壁法等。刘延龙等^［12］以Triton X-100法与经典法对比，前者琼脂糖凝胶电泳灵敏度为10条菌/ml，用Southern杂交其灵敏度为1条菌/ml。而经典法的灵敏度分别为100条菌/ml和10条菌/ml。翟秉详等^［13］报道Triton X-100法和Chelex法灵敏度均为10条菌/ml，其阳性率分别为93.3%和86.6%，与国内外报道^{［2，14-16］}相似。此类方法适用于实验室大批临床标本处理，且方法简便、经济。Buck等^［17］报道超声处理结果令人满意，灵敏度为10～100条菌/ml。标本处理及结核分支杆菌DNA的抽提方法选择裂解效能好、灵敏度和阳性率高的为宜。

(2)引物的多样性：目前常用检测分支杆菌的引物大致分为四类。①蛋白抗原编码基因：65 000蛋白抗原为分支杆菌细胞壁中热休克蛋白，是一种交叉反应蛋白，具有分支杆菌的特异性，无属内种的特异性。38 000抗原b(Pab)的DNA序列为结核分支杆菌和牛分支杆菌所特有。32 000蛋白抗原为结核分支杆菌特有。MPB 70蛋白抗原为牛分支杆菌特有。MPB 64蛋白基因序列为结核分支杆菌复合群(MTBC)特有。②结核分支杆菌基因组重复序列：目前最常用的引物为IS6110、IS986，均属MTBC特有。③结核分支杆菌特异序列mtp40，为结核分支杆菌特有。④分支杆菌dnaj基因，为分支杆菌共有。

PCR灵敏度与引物关系密切。李国利等^［18］对25株分支杆菌进行扩增位于编码分子量为65 000的分支杆菌表面抗原的基因内的一个383bp片段，结果表明除次要分支杆菌外，结核、牛、BCG、堪萨斯、海、瘰疬、鸟、胞内、猿、蟾、偶发和龟分支杆菌等均能被扩增。故用此引物扩增结果不可作为结核病的诊断依据，但在分支杆菌的鉴别方面具有一定价值。

扩增靶序列的拷贝数越多，灵敏度就越高。IS6110等插入序列存在于结核分支杆菌复合群，包括结核分支杆菌H₃₇Rv和H₃₇Ra 10～20个拷贝、牛分支杆菌2～3个拷贝、BCG 1个拷贝，也存在于非洲和田鼠分支杆菌中。此类序列可在染色体基因组上多次重复，故称重复序列。此为目前最常用的引物。但应用中也有假阳性和从非结核分支杆菌中扩增出IS6110产物的报道^［19-22］。另外据Yuen等^［23］报道，有的结核分支杆菌不具有IS6110片段，这种情况虽然少见，但确是存在。

由于环境的变化(如化疗药物的影响)引起结核分支杆菌DNA变异，发生缺失或点突变等，使引物不能与变异后的靶DNA结合，导致PCR假阴性，为此可选择多拷贝的靶序列或进行套式PCR扩增，以提高其灵敏度。

选择引物时需注意两引物间不应有大于4个碱基对以上的互补序列，尤其在3′端不应有任何互补碱基，若有两个则可产生显著的“引物二聚体”(primer-dimer)。

由于引物的多样化及PCR技术本身存在的问题，在选购试剂盒时必须了解是否有卫生部批准文号，了解试剂出厂日期、批号等，优先选择含尿嘧啶DNA糖苷酶(UNG)能防止DNA污染的试剂盒。

(3)PCR扩增产物分析：琼脂糖凝胶电泳分辨率较低，若两扩增片段长度相差在15 bp以下时则难以区分，只能作初步判断，不可作为可靠的临床PCR基因实验诊断依据。扩增产物DNA片段特异性应通过限制性核酸内切酶酶切及特异性分子探针进行核酸杂交等手段检测。

2.假阳性与假阴性的产生与防止：(1)假阳性：实验室假阳性结果的出现受诸多因素影响，除引物特异性差和判断结果错误外，大多属于靶DNA污染，如实验室布局不合理、气溶胶污染、混用加样器、一次性试管及吸头重复使用、试剂污染、手触试管内盖、混用一次性手套等。为了防止扩增产物的污染，实验室必须布局合理，可分为准备间(用于试剂的称量、配制及分装等)、样品处理间(用于样品收集、登记、模板制备)、基因扩增间(用于PCR基因扩增)、产物检测间(用于PCR产物检测)。各室内工作服及一切应用物品应固定，不得混用。需保持地面桌面整洁和室内温度恒定，不得使用电风扇。不得在各室内从事与实验无关的事宜。为防止各标本间的污染，要求严格操作规程，所用试管、加样器吸头等必须高压消毒，并一次性使用。操作时必须戴一次性手套(处理标本时戴乳胶手套)，并随时更换。取样加液时，动作快而轻，避免产生气溶胶。尽量减少取样次数，而且应就近操作，避免远距离移样。每次开启离心管前必先行短暂离心，并使用离心管专用扳手开盖，以防交叉污染。应先加反应试剂、后加样本DNA，并立即盖好后再行取样另加。用过的各离心管必须盖紧存放，或置于1 mol/L盐酸中浸泡，以防气溶胶污染。超净工作台使用前后必须用紫外线消毒20分钟。各重复使用物品及器具每日必须用消毒液浸泡消毒。(2)假阴性：主要受三方面因素影响。①试剂失效：DNA多聚酶失活、保存温度不当、反复冻融、保存过久。②标本处理不当：未提出DNA，残留抑制物NaOH、EDTA等，标本含DNA多聚酶抑制剂。③变性温度低不能解链，复性温度过高降低灵敏度。

为防止假阴性结果，试剂应冷藏保存，防止酶试剂失活及有机大分子降解。并应分装使用，避免反复冻融和减少污染机会。严格执行处理标本程序，去除标本内和各试剂残留的干扰扩增的抑制物质。定期监测扩增仪，并记录各项参数。

3.PCR实验室质量控制：(1)室间质控：由主管部门发放质控物，考核各级PCR实验室专业技术人员的理论和操作水平，以论文或答卷形式汇报室间质控结果。(2)室内质控：每批实验须设立裂解液空白对照管，检测裂解液及操作全过程的污染。裂解阳性对照管是在裂解前加入10²～10<