依托泊甙(VP-16)因对多种肿瘤细胞有杀伤作用而广泛应用于临床,但其具体作用机制存在争议。为此我们观察了VP-16诱导肺腺癌细胞凋亡规律,并探讨其内在作用机制。

材料与方法采用人肺腺癌细胞系AGZY-83-α^［1］,实验组VP-16的终浓度分别为2μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L和80 μmol/L,对照组加生理盐水,收集不同浓度药物处理不同时间的实验组及对照组细胞。形态学观察:(1)台盼蓝染色;(2)吖啶橙-醋酸染色;(3)末端脱氧核苷转移酶介导的生物素粘性末端标记（TUNEL);(4)透射及扫描电镜观察超微结构。DNA断裂分析:提取DNA,1.5%琼脂糖凝胶电泳。流式细胞仪测定DNA含量,位于G₀/G₁期二倍体峰之前的为凋亡峰(Ap峰)。

结果(1)4种浓度VP-16均能抑制细胞增殖,且随着时间延长、浓度增高,增殖抑制越明显。(2)形态学改变:40μmol/L VP-16作用6小时即出现形态改变,12小时具有典型凋亡特征:①光镜下:细胞变小、变圆,胞核固缩,染色质高度浓缩成亮黄色荧光;TUNEL方法:胞核呈棕黄色,浓缩的染色质紧贴核膜内侧呈均匀一致的染色。②电镜下:细胞收缩变圆,伪足消失,微绒毛减少,表面形成凋亡小体(图1，2)。(3)DNA断裂:凋亡细胞DNA在1.5%琼脂糖凝胶电泳上产生特征性的DNA条带,大小呈约180～200 bp整数倍递增,且随着药物浓度增高,DNA条带亮度增加(图3)。(4)流式细胞术:2 μmol/L～80 μmol/L的VP-16处理12小时,均出现Ap峰和G₂峰的升高,且随着药物浓度的增加,凋亡细胞的百分比从8%增至30%,G₂期含量由16%增至35%;40μmol/L VP-16作用2小时,Ap峰和G₂峰即升高,随时间推移到24小时,凋亡细胞从6%增至13%,G₂期由19%增至42%。

1：分子量标记物(λDNA/HindⅢ)，2：对照，3～6：分别为经2、20、40和80μmol/L的VP-16处理

图32 μmol/L～80 μmol/L VP-16处理12h，DNA断裂的凝胶电泳分析

讨论细胞数量是由细胞增殖和死亡之间的动态平衡来决定的,凋亡异常同肿瘤的发生、发展密切相关。本研究表明,VP-16能够诱导肺腺癌细胞凋亡,表现出典型的凋亡特征,并具有明显的时间和剂量依赖性。

过去认为,化疗药引起细胞坏死是其抗肿瘤的主要机制。本研究发现80μmol/L VP-16处理12小时,坏死率仅为8% ,而凋亡率为30%,说明诱导凋亡是其杀死肿瘤细胞的主要机制之一,这样在临床上可通过提高凋亡率来增加化疗效果。

VP-16的细胞毒性与其导致的DNA断裂有关^［2］。Walker等^［3］认为，DNA断裂基于二种机制:一是由于VP-16干扰拓扑异构酶Ⅱ对断裂DNA的重新连接反应,从而导致DNA的非特异性断裂。另一机制是由于激活Ca²⁺/Mg²⁺依赖性内源性核酸内切酶,在核小体连接区特异性切割DNA双链使其降解成180～200 bp或整数倍的寡核苷酸片段,凝胶电泳结果为DNA梯状改变。从本实验的结果推测,VP-16可以通过激活内源性核酸内切酶而使DNA特异性降解。

另外，VP-16可引起细胞周期的改变,将细胞阻滞于G₂期。其可能原因是,VP-16抑制p^34cdc2激酶(一种调节有丝分裂的周期调节蛋白)的活性,从而导致G₂期细胞含量相对增加^［4］。这一结果提示,在肿瘤化疗中,可先用VP-16将细胞调节到G₂期,再使用某些周期特异性药物来杀伤该期细胞以增强疗效。

参考文献

1王玉利，刑春华，王秀玉，等.人肺腺癌细胞系的建立和生物学特性.肿瘤临床，1985，12：184-187.

2Long BH, Musial ST, Brattain MG, et al. dNA breakage in human lung carcinoma cells and nuclei that are naturally sensitive or resistant to Etoposide. Cancer Res,1986,46:3809-3816.

3Walker PR,Smith C,Youdale T,et al. Topoisomerase Ⅱ reactive chemotherapeutic drugs induce apoptosis in thymocytes. Cancer res,1991,51:1078-1085.

4Lock RB, Ross WE. Inhibition of p34^cdc2 kinase activity by Etoposide or irradiation as a mechanism of G₂ arrest in Chinese hamster ovary cells. Cancer Res,1990,50:3761-3766.

(收稿：1998-07-10修回：1998-10-12)