关键词： 分支杆菌，结核；抗原，38 000蛋白质；重组体；高效表达

【摘要】目的通过结核分支杆菌38 000蛋白质抗原编码基因在大肠杆菌中稳定表达，以获得大量纯化的38 000蛋白质抗原，进而研究其免疫学特性。方法采用DNA重组技术构建结核分支杆菌38 000蛋白质抗原表达载体，双酶切和聚合酶链反应（PCR）鉴定转化子，阳性重组子转化大肠杆菌，并诱导表达外源蛋白；十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和免疫印迹法鉴定38 000蛋白质抗原在大肠杆菌中的表达；对染色的凝胶扫描，以测定目的蛋白质表达水平。诱导的工程菌抽提包涵体，以确定38 000蛋白质抗原在大肠杆菌中的表达形式。结果菌体蛋白经SDS-PAGE，含阳性重组质粒的菌体蛋白中出现一条新蛋白带，表达量占菌体总蛋白的36％～40％。肺结核患者的血清和结核分支杆菌免疫的羊血清与重组38 000蛋白质均呈阳性反应。38 000蛋白质抗原在大肠杆菌中表达方式主要以包涵体形式。结论构建的大肠杆菌重组体能高效表达结核分支杆菌38 000蛋白质抗原，包涵体的表达形式有利于蛋白质纯化和蛋白质稳定，蛋白质必须经过正确折叠才具有生物学活性。

The 38 000 protein of Mycobacterium tuberculosis is overexpressed in Escherichia coliHE Xiuyun^*, ZHUANG Yuhui, ZHANG Xiaogang, et al. ^*Tuberculosis Research Laboratory, The 309th Hospital of PLA, Beijing 100091

【Abstract】ObjectiveTo obtain recombinant 38 000 protein in large quantities and to study its immunologic characteristics by stable expression of the gene encoding for 38 000 antigen of Mycobacterium tuberculosis in E. coli.MethodsExpression plasmid was constructed with DNA recombinant technique. Positive clones were screened using double digestion and polymerase chain reaction. Recombinant plasmid was transformed into E. coli. Then E. coli carrying recombinant plasmid were induced. The expression of 38 000 antigen was identified by SDS-polyacrylamid gel electrophoresis (PAGE) and immunobloting. Stained gel was scanned to detect expression level of recombinant antigen.ResultsGel stained with coomassie blue G-250 showed that the induced E. coli carrying recombinant plasmid can produce 38 000 protein at high level. Gel scan showed that 38 000 antigen expression in E. coli was about 36%～40% of total cellular protein. The recombinant 38 000 antigen existed mostly in inclusion bodies. The recombinant antigen can react with antibodies: serum of pulmonary tuberculosis patients and the goats immuned with Mycobacterium tuberculosis.ConclusionsConstructed recombinant E. coli can overproduce 38 000 antigen of Mycobacterium tuberculosis. Inclusion bodies are easy to purify and can protect the recombinant antigen from protease, on the other hand, it has not biological activity unless the denatured protein is accurately folded.

【Key words】Mycobacterium tuberculosisAntigen，38 000 proteinRecombinantOverexpre-ssion

作为结核病皮试和免疫学诊断试剂的结核菌素纯蛋白衍生物（PPD）由多种蛋白成份组成，与多种分支杆菌抗原有交叉反应，寻找一种结核分支杆菌复合体特异的抗原在区分结核分支杆菌感染还是非结核分支杆菌感染方面具有重要的实际价值。用大肠杆菌作为分支杆菌抗原的生产车间，短期内可以获得大量的单一抗原。国外已报道多种分支杆菌抗原在大肠杆菌中表达^［1，2］，并对这些抗原的免疫学特性进行了初步研究。

结核分支杆菌38 000抗原具有强免疫性，对其免疫学和诊断作用已进行过研究^［3，4］，这些工作都是以结核分支杆菌本身合成的38 000抗原进行的。1989年，Andersen等^［5］在大肠杆菌中以融合蛋白形式表达38 000抗原，载体为PBR322；1992年，Singh等^［3］用表达载体pJLA603、启动子λP_LP_R高效表达非融合重组38 000蛋白，表达量为菌体总蛋白的10％；1994年，Souza等^［6］用表达载体PET3a，高效表达38 000蛋白，其表达量文中未报道；同年Chang等^［7］用聚合酶链反应(PCR)技术从λgt11基因文库中调出38 000抗原编码基因并在大肠杆菌中表达。

我们以Andersen等^［5］报道的38 000抗原编码基因设计引物，以H₃₇R_V基因组为模板，通过PCR获得38 000抗原编码基因，并与载体连接，然后在大肠杆菌中诱导表达。

材料与方法

一、材料

大肠杆菌k12由军事医学科学院提供，质粒由清华大学惠赠，肺结核患者血清由本院基因诊断室提供，结核分支杆菌免疫的羊血清由本室提供。限制性内切酶、T4 DNA连接酶购自Bio-Labs公司，尿素为Promega产品，标准核酸相对分子质量为上海生化所产品，Tag酶Plus Ⅱ购自Sangon公司，卡那霉素由本院结核科药房提供，DNA纯化试剂盒购自华绿渊公司，其它化学试剂均为分析纯。

二、方法

1.质粒DNA的制备、纯化、酶切按常规方法^［8］。

2.38 000抗原编码基因的制备：以H₃₇R_V基因组DNA为模板，用PCR技术获取目的基因。扩增产物按纯化试剂盒说明书纯化。

3.纯化的外源基因用与酶切质粒相同的两种限制性内切酶酶切、纯化，然后与上述处理的质粒连接、转化大肠杆菌，在含卡那霉素的LB固体培养基上筛选阳性菌落，双酶切及PCR技术鉴定重组质粒。以上操作均按常规方法^［8］进行。用ABI373型自动测序仪对阳性重组质粒DNA进行序列分析。

4.大肠杆菌感受态细胞的制备参见《分子克隆实验指南》^［8］。

5.外源基因在大肠杆菌中的诱导表达：阳性重组质粒按常规方法^［8］转化宿主菌，37℃孵育14～16小时。挑选单菌落于LB液体培养基中过夜培养，然后取1％接种于培养基中培养并诱导表达。

6.十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）：诱导菌体经处理后，在120 g/L分离胶和50 g/L浓缩胶中作垂直板SDS－PAG电泳。凝胶经考马斯亮蓝染色，对染色的凝胶扫描以检测目的蛋白表达水平。

7.免疫印迹(Western bloting)分析:将凝胶上的蛋白通过电转移装置转移到硝酸纤维素（NC）膜上。电转移结束后，将NC膜放入杂交袋内，加人8 ml封闭液封口后于37℃缓慢平摇30分钟；取出NC膜置于平皿中，用洗膜液洗膜3次，每次4分钟；再将NC膜置于杂交袋内，加入1∶300稀释的羊血清或1∶10稀释的人血清8 ml，封口后37℃缓慢平摇2小时；同前洗膜3次，把NC膜置于杂交袋内，加入1∶500稀释的HPR－标记二抗，37℃缓慢平摇1小时；同前洗膜3次，加入预先混和底物液，室温显色至适当将NC膜转移至蒸馏水中终止反应。

8.38 000抗原在大肠杆菌中的表达形式：工程菌诱导完备后，按常规方法^［8］提取包涵体，上清液和包涵体沉淀均取一部分与2×SDS凝胶加样缓冲液混匀，沸水浴3分钟，SDS-PAG电泳以确定表达方式。

结果

一、38 000蛋白质抗原编码基因

根据结核分支杆菌38 000抗原编码基因的序列设计合成一对引物。5′端引物设计了一个酶切位点，其序列为5′CGC ATG CCA TGG GCT CTA AAC CAC CGA GCG GTT CGC C 3′；3 ′端引物设计了另一个酶切位点和终止密码，序列为 5′CGG GAT CCT TAG CTG GAA ATC GTC GCG ATC AAC G 3′。以H₃₇R_V基因组DNA为模板经PCR扩增反应，产物经8 g/L琼脂糖凝胶电泳呈现特异性扩增条带，位置大约相当于11 000 bp，与预设的大小吻合。

二、阳性重组子的筛选和鉴定

在抗性培养基中生长的菌落，经培养后抽提质粒，质粒经双酶切或PCR扩增，琼脂糖电泳检测，能见外源基因DNA条带，即阳性重组子质粒。结果见图1。

1 标志物(λDNA HindⅢ+EcoRI)，2 重组质粒单酶切，

3 重组质粒双酶切，4 质粒为模板的PCR产物

图1重组质粒的酶切和PCR扩增鉴定

三、结核分支杆菌38 000蛋白质抗原在大肠杆菌中诱导表达及表达形式

诱导的工程菌全菌体蛋白经SDS－PAG电泳，携带阳性重组质粒的大肠杆菌菌体蛋白中多一条相对分子质量大约36 000的蛋白带，含空载体的菌体无此蛋白带。重组38 000抗原主要以包涵体形式存在，结果见图2。