在结核病传统实验室诊断方法中，抗酸染色镜检阳性率仅30％左右；结核菌素皮肤试验阳性率约为75％，但有假阳性问题；培养结果虽可靠，但需时3～8周。因此，多年来国内外学者一直在寻找快速、敏感、特异、简便的实验室诊断方法。在应用新的实验技术过程中，也发现存在一些问题，值得重视。

同其他细菌一样，结核分支杆菌在不利环境中受物理、化学（药物）及免疫学因素的影响，细胞壁发生缺陷型变异，形成L型菌。国内多家院所先后报道用改良的胰胨大豆蛋白琼脂培养基（TSA-L）和快速蛋白胨琼脂牛血清培养基、羊血培养基分离培养L型结核分支杆菌。有作者报道77例痰菌培养阴性肺结核患者痰标本L型菌阳性分离率18.2%，51例结核性脑膜炎患者脑脊液阳性分离率17.0%；有的报道高达45.5%；1998年有人报道260例复治、难治肺结核患者的L型结核分支杆菌阳性率为29.6%。由此可见，开展结核分支杆菌L型的研究与检测，了解主要培养基与培养条件、临床标本的前处理标准化及L型检测、鉴定方法与临床意义等，对研究结核分支杆菌变异菌的生物学性状和提高痰菌阴性肺结核的阳性诊断率十分重要。

近年来，国内外学者采用脂阿拉伯甘露聚糖（LAM）、脂多糖（LPS）、结核分支杆菌重组蛋白（相对分子质量38 000）或其他纯化蛋白作为抗原，以胶体金标记，建立简便、快速免疫学诊断方法。各研究者在检测结核患者血清、胸腔积液的抗结核抗体方面，尽管因病例、病程与治疗方案未经严格选择，其敏感性尤其特异性不尽相同，也无可比性，但从总体上看，同以PPD作为抗原的酶联免疫吸附试验（ELISA）结果并无本质上差别。以ELISA为代表的免疫学方法在国内应用较广泛，结核特异性抗原免疫印迹技术敏感性89.7%，特异性95.7%，是结核病的有用辅助诊断方法，尤其对肺外结核、菌阴肺结核的诊断具有应用价值。对于新近报道的快速免疫诊断试验，须经严格设计、选例及较大数量标本的验证，待界定临床意义后将有助于结核病的早期快速诊断。

聚合酶链反应（PCR）技术自1983年Mullis等发明以来，显示出了灵敏度高、特异性强、快速等特点。我国在PCR技术的应用方面，已积累了一定的资料和经验，目前正处于由实验室向临床试用的重要转折阶段。由于结核病诊断缺乏“金标准”，各研究病例的选择标准和PCR实验方法不同，因此各实验室间PCR检测结核分支杆菌的敏感性和特异性难以比较。PCR检测临床标本假阳性和假阴性问题是检验人员和临床医师共同关心的首要问题。出现假阳性，主要与特异性核酸污染、引物特异性不高和电泳结果误判有关。假阴性问题，主要与标本中存在抑制因子、标本前处理与DNA抽提方法不当、非结核分支杆菌感染和试剂质量不过关等有关。操作人员的素质、技术熟练程度等亦有影响。对这些问题的深入研究、有国家批号PCR试剂盒的正式投入市场、操作技术的标准化及临床意义的界定，将无疑会推动PCR技术的临床应用。

DNA探针技术是在适当温度、离子强度和pH条件下，DNA探针与其互补的DNA单链配对，经放射自显影或非放射性标记物显示系统探测结果。分支杆菌的DNA探针有4种主要类型：cDNA或rDNA探针，全染色体DNA探针，克隆的DNA或PCR扩增片段探针及寡核苷酸探针等。在DNA探针标记上，目前国内外均着力于研究非放射性标记，其中PCR法较为简便。DNA探针的缺点是检测临床标本的灵敏度较低，一般标本中细菌数为1×10⁴/ml时才能呈现杂交阳性反应。近几年国外报道将碱性磷酸酶（AP）显色系统和辣根过氧化物酶(HRP)显色系统的底物，换成一种经酶促分解后可产生光子的发光底物，若加入发光增强剂可使发光强度增加1 000倍。还有报道用细菌荧光酶检测杂交信号的，其灵敏度比AP或HRP显色系统高100倍。特异性强的DNA探针与灵敏度高的PCR技术结合，已成为结核病诊断的研究和应用的一种良好途径。

近年来，国内外学者采用分子遗传学方法研究几种主要抗结核药物作用的分子机制及其耐药性的分子基础，建立了快速检测结核分支杆菌耐药基因型分子生物学技术。基因突变检测技术是在PCR技术的基础上发展起来的，主要有PCR-单链构象多态性(PCR-SSCP)、PCR-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）分析和PCR-DNA序列测定。研究发现：耐利福平主要是由于药物作用靶分子RNA聚合酶β亚单位（rPOB）的突变。在结核分支杆菌耐利福平分离株中，93％～95％左右rPOB序列内的不同位点存在多种突变，一般发生在507～533位。当然，也需考虑rPOB区域其他部位发生突变的可能性。大多数耐链霉素菌株是由于核糖体蛋白S12编码基因(rPSL)和16s rRNA编码基因（rrs）突变所致。在结核分支杆菌耐链霉素菌株中，70％～85％有rPSL和rrs基因突变。耐异烟肼与过氧化氢酶-过氧化物酶编码基因(katG)和烯酰基还原酶编码基因（inhA）或烷基过氧化氢酶编码基因(ahpC)突变有关。耐异烟肼分离株50％～76.2％的katG基因有突变，12％在inhA调节序列上有突变。ahpC基因突变检出率为16.6%。耐吡嗪酰胺是由于吡嗪酰胺酶编码基因（pncA）突变，使吡嗪酰胺酶活性丧失或降低，不能将吡嗪酰胺转变为活性型。72％的耐吡嗪酰胺结核分支杆菌分离株有pncA基因突变。耐乙胺丁醇与阿拉伯糖基转移酶编码基因(embABC)操纵元突变有关。69％结核分支杆菌耐乙胺丁醇分离株有embB基因突变，89％发生在306位氨基酸密码子。耐喹诺酮类是由DNA回旋酶A亚单位（gyrA）和B亚单位(gyrB)基因突变所致。突变集中在gyrA基因的保守区。在耐异烟肼、利福平、链霉素的分离株中，85％有异烟肼、利福平、链霉素遗传标记改变，20％～30％有2种耐药遗传标记改变，10％～15％只有rpoB点突变。其他途径的耐药机制有待深入研究。今后应更广泛研究主要抗结核药物靶基因突变与耐药性的关系，寻找更简便、实用的检测技术，用于分子药敏实验。

据国内外文献报道，基于16s～23s rDNA(rRNA)间隔区序列高变性特点，设计引物先行PCR扩增，后行RFLP分析，可快速鉴定分支杆菌。临床标本中能分离出的22种分支杆菌除3种酶切图谱没有差异外，86％在2～3天内可鉴定到种的水平，10种受试的相关非分支杆菌也能区分开，表明PCR-RFLP是菌种鉴定的一种快速有效方法。也有报道用多重PCR技术快速鉴定结核分支杆菌复合体与非结核分支杆菌，即用一对引物针对分支杆菌属基因标志（扩增产物为383bp片段），另一对引物扩增仅存在于结核分支杆菌复合体的插入序列IS1081的一个片段（扩增片段为238bp），1～2天内可鉴别结核与非结核分支杆菌。这类技术尽管处于实验研究阶段，但因操作简便，重复性好，值得从实验条件与临床应用验证等方面深入研究改进，制定出分支杆菌分类鉴定的方案。

总之，结核病许多新的实验室诊断技术在我国已得以应用，尽管在实际工作中还存在一些问题，但只要广大医务工作者对存在问题予以足够重视，逐步解决试剂的标准化、操作的规范化及临床意义的界定等问题，这些技术必将在我国结核病的诊断方面发挥更大作用。

（收稿：1998-11-20修回：1998-12-08）