关键词： 聚合酶链反应；结核，支气管；活组织检查

【摘要】目的了解巢式聚合酶链反应(NPCR)技术对支气管内膜结核的诊断价值。方法应用巢式聚合酶链反应(NPCR)对67份支气管内膜活检组织进行结核分支杆菌DNA检测，并与病理检查、刷检涂片、支气管镜检后痰涂片和痰培养结果比较。对照为43例支气管肺癌患者。结果67例支气管内膜结核活检组织病理检查、刷检涂片、支气管镜检“激惹”后痰涂片、镜检术后痰培养及NPCR检测阳性率分别为13%、19%、22%、15%和76%，后者与前四者相比差异有非常显著性(P均＜0.01)。43例支气管肺癌患者结核分支杆菌DNA的NPCR无一例阳性。结论巢式PCR技术有益于支气管内膜结核患者的诊断，特别是对胸片正常、痰菌阴性、支气管内膜活检组织未发现结核特异性病理变化者颇具诊断价值。

Nested polymerase chain reaction in detecting Mycobacterium tuberculosis DNA in bioptic tissue from patients with endobronchial tuberculosisMA Lu^*, MIAO Lingjuan, QIN Songshi, et al.The 460th Hospital of the PLA, Zhengzhou 450007

【Abstract】ObjectiveTo evaluate the nested polymerase chain reaction (NPCR) technique in diagnosing endobronchial tuberculosis.MethodsNPCR method was used to detect Mycobacterium tuberculosis DNA in bioptic tissue from 67 patients with endobronchial tuberculosis, and the results were compared with pathologic examination, brushing smear, sputum smear and culture for Mycobacterium tuberculosis after bronchoscopy. The controls were 43 patients with lung cancer.ResultsThe positive rates of detecting Mycobacterium tuberculosis were13%,19%,22%,15% and 76% respectively by pathologic examination, brushing smear, sputum smear, culture after bronchoscopy and NPCR methods. Significant differences were found between NPCR and the other 4 methods (all Ps＜0.01). No positive result for Mycobacterium tuberculosis was found in 43 controls by NPCR.ConclusionsNPCR is a useful method for diagnosing patients with endobronchial tuberculosis, especially for those with normal demonstration in X-ray chest film, negetive sputum and nonspecific pathologic changes in endobronchial biopsy.

【Key words】Polymerase chain reactionTuberculosis, bronchialBiopsy

支气管内膜结核发病率近年来逐渐增高，其临床误诊率可达68.6%，其中误诊为肺癌者高达30%^［1］。尤其是当患者干咳无痰或痰菌阴性、胸片正常、纤维支气管镜(纤支镜)活检未能发现典型的结核病理改变时，诊断更难。我们对支气管内膜组织进行结核分支杆菌DNA巢式聚合酶链反应(NPCR)检测，以提高支气管内膜结核的检出率并避免一般聚合酶链反应(PCR)所出现的假阳性。现将结果报告如下。

材料与方法

一、材料

1.研究对象：共110例患者。其中43例为原发性支气管肺癌，经活检证实。67例为支气管内膜结核，男42例，女25例，病程6个月～3年，均有咳嗽、发热、盗汗。咳痰34例，咳血(或血痰)13例。67例支气管内膜结核胸片均正常或肺纹理增粗，患者为病理活检、刷检涂片、镜检术后痰涂片及痰培养至少一项阳性者且抗结核治疗有效。

2.标本的收集：采用Olympus BF-1T₁₀、BF-B₂、BF-P₂₀等型纤支镜，镜检直视下于粘膜有病变处钳取活体组织3～5块行NPCR检测，钳检完毕后作刷检。活检标本用4%甲醛固定、常规脱水、石蜡包埋、切片和HE染色。刷检标本作涂片、染色查找抗酸杆菌。

3.引物合成：根据吴勤学等^［2］报道的序列合成：(1)外引物：GTG GCC CAG ATC CGC CAG CAT GTC GCC GCC ACC GGG AA；(2)内引物：TTG CAA GCG GCC CCG ACCC CCA CCG GGA ACG GAA GCC TT。

4.主要试剂和仪器：Tag DNA聚合酶和脱氧核糖核苷酸(dNTP)购自Promega公司，其他试剂均购自华美公司，PCR扩增仪购自北京新技术研究所。

二、模板DNA制备及NPCR扩增过程

取活检组织10 mg，加10 mmol/L Tris-HCL(pH 8.0)、5 mmol/L MgCl₂、0.32 mol/L蔗糖、体积分数0.01的Triton X-100、100 g/L十二烷基磺酸钠、1 mg/ml的蛋白酶K，70℃，1小时后加入溶菌酶至终浓度1 mg/ml，37℃，30分钟。用酚∶氯仿∶异戊醇抽提2～3次，离心取液相加入核糖核酸酶(RNase)，37℃，作用2小时，用异丙醇沉淀DNA。先用外引物对将DNA模板放大25个循环(条件为：94℃变性3分钟后94℃ 70秒，55℃ 2分钟，72℃ 2分钟，最后72℃延伸8分钟)，后用内引物对再放大25个循环(条件同第一次放大)，取其产物在12 g/L琼脂糖胶(内含溴乙啶0.5 μg/ml)上进行电泳，待溴酚蓝泳至胶面一半处，紫外检测可见344 bp的桔红色条带。

结果

43例原发性支气管肺癌患者的活检组织结核分支杆菌DNA的NPCR无一例阳性。67例支气管内膜结核的阳性检出率分别为：活检标本病理检查13%、刷检涂片19%、镜检术后痰涂片为22%、镜检术后连续痰培养15%、活检组织结核分支杆菌DNA的NPCR为76%。经χ²检验，NPCR与其他4种方法比较均有显著性差异，均为P＜0.01。

讨论

支气管内膜结核经纤支镜进行活检、刷检以及纤支镜检的“激惹”作用和冲洗使排痰增加，可提高阳性检出率，但阳性率仍很低，镜检术后连续痰涂片阳性率仅为18%，术后痰培养则更低^［3］。而且支气管内膜结核的病理全过程有多种改变，包括粘膜炎症、溃疡、干酪样坏死、结核结节、过度增生的肉芽和纤维化等，而活检时不一定能获得典型的结核结节^［4］。PCR检测各种临床标本中结核分支杆菌具有快速、敏感、特异之优点，但容易出现假阳性，即污染^［5］和特异性的问题。有报道假阳性率可高达14.3%^［6］。有作者发现假阳性大部分为肺部恶性肿瘤所致^［7］。而NPCR用内引物和第二次放大时循环次数少，减少背景带而增加了特异性，且最后产物以内引物特异性为基础放大，与外引物不同，从而克服了污染^［8］。我们用NPCR对支气管内膜活检组织进行结核分支杆菌DNA检测，共110份标本，67例确诊为支气管内膜结核患者NPCR的阳性检出率为76%，明显优于病理镜检、刷检涂片、镜检“激惹”后痰涂片及痰培养检查(P＜0.01)。43例确诊为原发性支气管肺癌(活检证实)的活检组织在本次结核分枝杆菌DNA的NPCR实验中无一例阳性。我们认为对于临床上高度怀疑支气管内膜结核的患者，尤其是胸片正常、痰菌阳性且病理无确实把握证实为结核者，对活检组织进行NPCR是值得信赖的检测方法。只要严格试验标准，假阳性结果是有可能避免的。

参考文献

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2吴勤学，李新宇，魏万惠，等.套式结核菌基因扩增试验的建立及初步应用.中华结核和呼吸杂志，1994，17：294-296.

3中华结核和呼吸杂志编辑委员会.痰菌阴性肺结核的诊断和治疗座谈会纪要.中华结核和呼吸杂志，1995，18：324-327.

4杨远，周淮英，杨萱芝，等.纤维支气管镜检对胸片正常的支气管内膜结核的诊断价值.中华结核和呼吸杂志，1995，18：12.

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6施焕中，李超乾，龙学明，等.聚合酶链反应在诊断结核性胸腔积液中的应用.中华结核和呼吸杂志，1994，17：286-287.

7张言斌，谭耀驹，谭守勇，等.聚合酶链反应用于涂阴结核早期诊断的评价.中华结核和呼吸杂志，1998，21：60.

8Plikaytis BB, Gelber PH, Shinnick TM, et al. Rapid and sensitive detection of M.Laprase using a nested-primer gene amplification assay. J Clin Microbiol, 1990,28:1913-1917.

(收稿：1998-08-14修回：1998-11-09)