关键词： p16基因；p53基因；p21基因；肺肿瘤；基因治疗

【摘要】目的观察肿瘤抑制基因p16、p53及细胞周期依赖激酶抑制物p21基因单独或联合应用时对肺癌细胞增殖的影响。方法应用十八酰基胺阳离子脂质体介导p16、p53、p21基因单独或共转染到非小细胞肺癌细胞系A549和小细胞肺癌细胞系SH77，观察转染后1、3、5日该细胞增殖的活力。采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)测定吸光度(A)，以检测细胞增殖活力。结果A549细胞系：A均值分别为：空白组0.7856，脂质体组0.7478，p16组0.5589，p21组0.6022，p53组0.5778，p16+p21组0.4711，p16+p53组0.3017，实验组与对照组比较P＜0.01，以共转染p16+p53组最强。SH77细胞系：A均值分别为：空白组1.0222，脂质体组0.9316，p16组0.9137，p21组0.8889，p53组0.8356，p16+p21组0.5933，p16+p53组0.4278，单转染实验组与对照组比较P＞0.05；共转染实验组与对照组比较P＜0.01，以p16+p53组更明显。结论p16、p53和p21 基因有可能成为非小细胞肺癌基因替代治疗的候选基因，联合应用p16与p21基因或p16和p53基因能显著增强对肺癌细胞增殖的抑制。

The efficacy of p16, p53 and p21 genes on the proliferation of lung cancer cells in vitroWEN Guilan, LI Jiangqi, ZOU Guoming, et al. Molecular Medical Center, Second Affiliated Hospital, JiangXi Medical college, Nanchang, 330006

【Abstract】ObjectiveWhether the p16, p21and p53 genes inhibit the proliferation of lung cancer cells after transfecting the genes alone or jointly was examined.MethodsThe p16 ,p21 and p53 genes mediated by Stearylamine/DOPE (SA liposome) were introduced alone and jointly into the non-small cell lung cancer(NSCLC) cell line A549 and small cell lung cancer (SCLC) SH77.The effect of the genes on the growth of the cells was detected by MTT method at day 1,3,5 after gene transfection.ResultsThe p16 , p53 and p21 genes alone mediated by SA liposome can inhibite obviously the growth of NSCLC cell line A549 cells, while the genes were slightly effective on SCLC cell line SH77 cells at day 1,3,5 after transfecting the genes. But co-transfecting p16 and p21 or p16 and p53 can enhance the inhibiting effect on both A549 and SH77 cells significantly. ConclusionsThe tumor suppressor genes p16, p53 genes and CDK inhibitor p21 gene may be candidate for gene replacement therapy of NSCLC. Co-transfecting p16 gene and p53 gene may be a better choice.

【Key words】p16 genep53 genep21 geneLung neoplasmGene therapy

p16、p53、p21基因编码的P16、P53、P21蛋白，能直接或间接地抑制细胞周期依赖激酶（cyclin-dependent kinase,CDK）活性，负调控细胞周期，抑制细胞增殖。为了探讨单独及共转染p16、p53、p21基因治疗肺癌的价值及方法，我们应用十八酰基胺阳离子（stearylamine,SA）脂质体介导这些基因转染到非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系A549和小细胞肺癌(SCLC)细胞系SH77中，观察三种基因单独及联合应用对A549细胞和SH77细胞增殖的影响，以探索它们在基因治疗中应用的可能性。

材料与方法

一、细胞系

NSCLC细胞系A549及SCLC细胞系SH77，购自上海细胞生物学研究所。用补充10%小牛血清的RPMI-1640培养基培养。

二、p16基因缺失检测

正常人淋巴细胞(对照组)和A549细胞基因组DNA提取按Okamoto等^［1］所述方法进行。p16基因外显子2 引物（购自北京医科大学病理教研室）序列为:Sense 5′ACAAGCTTCCTTTCCGTCATCCCG 3′;AntiSense 5′TCTGAGCTTTGGAAGCTCTCAG3′。PCR条件为: 94℃ 1分钟预变性，94℃ 1分钟、57℃ 1分钟、72℃ 1分钟，35个循环，72℃ 5分钟延伸。PCR扩增产物为420 bp。PCR产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳，在透射紫外灯下观察结果。

三、基因转染及表达

p16、p21、p53 cDNA表达型质粒由美国华盛顿大学吴瑛博士赠送，cDNA均经测序证实。SA阳离子脂质体(购自上海生物化学研究所)介导p16、p53、p21 基因转染按杨静平等^［2］方法，脂质体与质粒DNA重量比为10∶1。Western blot检测P16蛋白和P53蛋白的表达:当A549细胞生长达80%汇合时收获细胞，取3个直径60 mm培养皿，每皿接种8×10⁵个细胞，其中2皿按文献［2］方法，每皿转染p16或p53质粒3 μg-SA脂质体30μg复合物, 另1皿为对照细胞, 转染基因后48小时和96小时收获细胞。蛋白质提取、十二烷基硫酸钠-聚丙酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳、蛋白质电转移、封闭、抗原抗体反应、显色均按姜泊等^［3］方法进行。采用生物素-碱性磷酸酶显色系统显色。

四、肿瘤细胞增殖抑制实验

当A549及SH77细胞达80%汇合时分别收获，以每孔1×10⁵个细胞接种于96孔培养板(NUNC)，分为转染基因后1、3、5日共3板，每板设A549和SH77两大组，每大组再分以下7组即: (1)空白对照组；(2)脂质体组(SA 20 μg/孔)；(3)p16组(SA 20 μg-p16 2 μg/孔)；(4)p21组(SA 20 μg-p21 2 μg/孔)；(5)p53组(SA 20 μg-p53 2 μg/孔)；(6)共转染p16与p21组(SA 40 μg-p16 2 μg-p21 2 μg/孔)；(7)共转染p16与p53组(SA 40 μg-p16 2 μg-p53 2 μg/孔)，每组设3个平行孔。观察转染后第1、3、5日各组A549和SH77细胞增殖情况。细胞增殖活力检测：采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)^［4］，以570 nm为最大吸收波长比色，测各孔吸光度(A值)，并计算各组的抑制率｛抑制率%=［对照组(A)-实验组(A)］/对照组(A)×100%｝。

五、统计方法

采用方差分析及均数间的相互比较，处理实验数据以观察p16、p21、p53基因单独或联合应用时的作用。

结果

A549细胞p16基因缺失检测，在正常人淋巴细胞可见位于515与375 bp之间的扩增条带，A549细胞未见扩增条带，表明A549细胞存在p16基因外显子2缺失。Western blot检测SA脂质体介导p16和p53基因分别转染到A549及SH77细胞后48小时及96小时均见紫红色阳性蛋白条带，未转染基因的对照组未见条带，表明p16和p53基因已成功地转染并有表达。

SA阳离子脂质体介导p16、p21和p53基因单独及共转染对A549细胞增殖的影响，见图1。SA阳离子脂质体介导p16、p21和p53基因单独及共转染对SH77细胞增殖的影响，见图2。单独转染p16、p21和p53基因后第1、3、5日与空白对照组或脂质体对照组比较A549细胞的A值显著降低(P＜0.01)；但SH77细胞的A值未见明显降低（P＞0.05）。表明p16、p21和p53基因均能显著抑制A549细胞增殖，对SH77细胞的抑制作用则不明显。在共转染p16和p21基因及p16和p53基因后1、3、5日，与单独转染比较，A549细胞A值均显著降低（P＜0.01），SH77细胞A值也明显降低（P＜0.05～0.01），表明共转染 p16和p21基因及p16和p53基因能增强抑制两种细胞的作用，尤以p16和p53基因组抑制作用最强，见图3，4，从图3，4可看出单独或联合转染时对两种细胞不同的抑制率。

转染天数

图1单独和共转染p16、p53和p21基因对非小细胞肺癌细胞系A549细胞增殖的影响

转染天数

图2单独和共转染p16，p53和p21基因对小细胞肺癌细胞系SH77细胞增殖的影响

转染天数

图3单独和共转染p16，p53和p21基因对非小细胞肺癌细胞系A549细胞抑制率

转染天数

图4单独和共转染p16，p53和p21基因对小细胞肺癌细胞系SH77细胞的抑制率

讨论

恶性肿瘤的基因治疗是当今攻克癌肿研究的主要方向。本研究应用SA脂质体介导p16转染到有p16基因纯合性缺失的A549细胞，经Western blot分析探测到P16蛋白表达，表明SA阳离子脂质体能有效地介导基因转染细胞。过去普遍认为阳离子脂质体转染效率低，但近几年研究发现，新一代阳离子脂质体如(±)-N-(3-氨丙基)-N，N-二甲基-2，3-二(十二烷氧)-1-溴丙铵/二油酰磷脂酰乙醇胺（GAP-DLRIE/DOPE）较过去裸DNA转染效率提高了1 000～10 000倍^［5］。脂质体转染效率之所以显著提高，首先因为质粒重组的改进，如本<