我们利用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色分析法^［1］观察抗人白细胞介素5单克隆抗体(hIL-5mAb)对外周血嗜酸粒细胞(EOS)存活力的影响。

材料与方法试剂：胎牛血清(FCS)美国Gibco公司生产；RPMI 1640(美国Sigma公司生产)，四甲基偶氮唑盐(MTT)、台盼蓝、Dextran、Ficoll和Percoll购于华美公司；人白细胞介素5(hIL-5)为英国Pepro Tech公司产品；十二烷基磺酸钠(SDS)为德国Boehringer进口分装；抗hIL-5mAb为本室自备。

方法：(1)EOS悬液的制备^［2］：肝素抗凝血经4%Dextran+Ficoll沉降红细胞后，加于不连续密度梯度的Percoll上，室温以2 000 r/min离心20分钟，收集介于1.095～1.100 g*ml^-1之间的细胞层，洗涤后用台盼蓝染色法计数活细胞，并用含10%FCS的RPMI 1640调整细胞密度至1.6×10¹⁰*L^-1备用。(2)EOS最适培养密度：将上述细胞悬液倍比稀释，加于96孔培养板上，每孔100 μl，设3个复孔，置5%CO₂孵箱中37℃孵育48小时，每孔加入20 μl MTT液［MTT 5 g*L^-1,PBS 0.2 mol*L^-1(pH 7.4)，NaCL 0.02 mol*L^-1,0.5%葡萄糖］置CO₂孵箱中培养4～6小时；每孔加入100 μl裂解液(10% SDS，pH 4.5)过夜，于酶标仪(BIO-RAD，美国)上测570 nm处的吸光度(A₅₇₀)值，按下式计算EOS存活率。

(3)EOS最适培养时间：按最适培养密度(1×10^9.L^-1)将EOS加于96孔板上，置5%CO₂孵箱中37℃孵育，按上述方法分别计算培养12、24、48、72、96、120、144、168、192、216和240小时的EOS存活率。(4)hIL-5对EOS存活率的影响：将EOS加于96孔板上，再加不同浓度的hIL-5，每个稀释度设3个复孔，同时设阴性对照，孵育48小时，同法计算EOS存活率。(5)抗hIL-5mAb对EOS存活率的影响：加EOS于96孔板上，再加入含10 mg*L^-1hIL-5及不同稀释度mAb腹液的10%FCS RPMI 1640，每种抗体、每个稀释度设3个复孔，同时设hIL-5和阴性对照，孵育48小时后，同法计算EOS存活率，按下式计算抑制率。

结果所获得的嗜酸粒细胞纯度＞90%，活力＞95%，为细胞存活力测定创造了良好的条件。EOS最适培养密度为1×10⁹*L^-1，此培养密度的EOS在培养24～48小时时存活力下降最为明显，故新鲜制备的EOS在培养48小时时测定其存活力较为敏感。EOS对hIL-5浓度在0.25～8.00 mg*L^-1时有一定的剂量依赖性。当hIL-5浓度＞8.0 mg*L^-1时，48小时EOS存活率较为稳定地保持在75%左右；而当hIL-5浓度＜0.25 mg*L^-1时，其促进EOS存活的作用明显减弱。7株mAb中有5株(2H10、3G5、3D6、1H1和3H7)具有抑制EOS存活的作用，抑制率分别为80%、67%、56%、55%和47%。

讨论IL-5是由T淋巴细胞分泌的细胞因子，促进EOS增殖、成熟、活化并募集至气道粘膜^［3］。EOS活化后释放毒性蛋白和炎性介质，造成气道粘膜损伤、气道炎症的发生^［4］。研究表明，抗IL-5 mAb不仅抑制了哮喘豚鼠EOS的活化、脱颗粒和浸润，而且降低了其气道反应性^［5］。这既说明IL-5参与了哮喘气道炎症的发生，也说明调整循环和(或)局部的IL-5水平，有可能抑制EOS介导的组织损伤，从而减少或控制哮喘的发生。

在深入研究IL-5及其受体的结构和功能的基础上，我们自行设计并合成了hIL-5羧基端19肽，拟利用其作为抗原替代IL-5制备出具有结合和阻断活性的抗hIL-5抗体。经细胞融合获得7株对hIL-5有结合活性的mAb。

以往的研究证实，2H10、3G5、3D6、1H1和3H7等5株mAb具有阻断hIL-5促进TF-1细胞增殖的活性，本组研究显示，这5株mAb同样具有抑制EOS存活力的作用。最大浓度的mAb并未使48小时的EOS存活率降至阴性对照水平，分析认为：加入的hIL-5在未被抗体中和之前，即有部分与EOS表面的抗体结合，因而使48小时时的EOS活细胞数增加。

本课题受国家自然科学基金资助(基金编号：39470324)

参考文献

1Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application of class-specific antibody in mouse serum. J Immunol Methods，1983, 65: 55-64.

2Frick WF，Sedgwick JB, Busse WW. The appearance of hypodense eosinophils in antigen-dependent late phase asthma. Am Rev Respir Dis, 1991,139: 1401-1406.

3Ohnishi T. IL-5 is the predominant eosinophil-active cytokine in the antigen-induced pulmonary late-phase reaction. Am Rev Respir Dis, 1993, 147: 901-907.

4孙滨.哮喘发病机理及治疗进展.中华结核和呼吸杂志，1993，16：1-2.

5Antoon J, Njikamp F. Effect of anti-IL-5 and IL-5 on airway hypereactivity and eosinophils in guinea pigs. Am Rev Respir Dis, 1993, 147: 548-552.

(收稿：1998-06-08修回：1998-09-09)