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【摘要】目的探讨博莱霉素致大鼠肺间质纤维化肺组织前胶原Ⅰ、前胶原Ⅲ及肿瘤坏死性因子α(TNF-α)mRNA表达的变化及意义。方法30只大鼠随机分为: (1)正常对照组 5只, 经气管内一次性灌注生理盐水; (2)灌注博莱霉素分为博莱霉素3、7、14、21、30天组,每组各5只。灌注博莱霉素后，分别在相应的时间点取肺组织，提取总RNA,用RNA吸印杂交(Northern杂交)和斑点杂交测定肺组织的TNF-α、前胶原 Ⅰ,前胶原 Ⅲ 的mRNA。结果灌注博莱霉素3和7天组肺组织的TNF-α mRNA的表达与正常对照组比较，t值分别为10.33、12.54(P＜0.01);博莱霉素7天组前胶原 Ⅰ、前胶原 Ⅲ 的 mRNA开始表达 ,与正常对照组比较t值分别为10.56、24.23(P＜0.01)；14天组达到峰值水平; 博莱霉素30天组的前胶原Ⅰ mRNA与正常对照组比较t值为16.67(P＜0.01)；而前胶原Ⅲ的mRNA水平与正常对照组比较t值为1.95(P＞0.05)。 Northern杂交显示,前胶原 Ⅰ、前胶原 Ⅲ 的mRNA均有两个转录模板。结论(1)博莱霉素致肺间质纤维化时,前胶原 Ⅰ和前胶原 Ⅲ 基因表达增加, 胶原基因转录水平的升高,引起的胶原合成加速是肺间质胶原积聚的主要原因。(2)TNF-α mRNA在急性肺泡炎期表达增强,在肺间质纤维化的发生和发展中起了重要的作用。
Gene expression of messenger RNA coding for procollagen and tumour necrosis factor-α in lungs undergoing bleomycin-induced pulmonary fibrosis.
Cai Hourong,Zheng Peide, Dai Lingjuan, et al. Dept. of Respiratory Disease, Gulou Hospital, Nanjin 210008
【Abstract】ObjectivemRNA for tumour necrosis factor-α(TNF-α) and procollagen Ⅰ ［pro α1(Ⅰ)］ and Ⅲ(pro α1(Ⅲ)was measured in bleomycin treated mice to evaluate their roles in pulmonary fibrosis .Method30 male Wistar mice were divided into normal control group and groups treated by bleomycin on days 3,7,14,21,30.Each group included 5 mice, and the mice were treated by single intratracheal instillation with sterile saline solution or with 5 mg /kg body weight of bleomycin. The mice were sacrificed at different days , and total RNA from the lungs of bleomycin or saline solution instilled mice was extracted. Expression of TNF-α, pro α1 (I) and pro α1(Ⅲ)mRNA was measured by dot blot and Northern blot hybridization.ResultThe levels of TNF-α mRNA in lungs of bleomycin groups on days 3,7 were significantly higher than those of control group (t=10.33 and 12.54 respectively ; P＜0.01). The levels of pro α1 (I) and pro α1(Ⅲ)mRNA in lungs of bleomycin group on day 7 were higher than those of control group(t=10.56 and 24.23 respectively ; P＜0.01), After reaching the peak levels in two weeks, the levels of pro α1(Ⅲ) mRNA in lungs of bleomycin group on day 30 declined slowly to approximately the values of normal control group (t=1.95;P＞0.05); but the levels of pro α1(Ⅰ) mRAN on day 30 after bleomycin administration were higher than those of control group ( t=16.67; P＜0.01). The mRNA coding pro α1(Ⅰ) and pro α1(Ⅲ) in lungs of mice had two mRNA species.ConclusionThe results suggested that the metabolism of mRNAs for pro α 1 (Ⅰ) and pro α 1 (Ⅲ) may be preferentially perturbed, and that increase of collagen gene expression in the transcriptional level might be involved in the mechanism of collagen accumulation. The increased expression of TNF-α gene may play an important role in the early events of bleomycin-induced pulmonary fibrosis.
【Key words】Pulmonary fibrosisCollagenTumour mecrosis factor-αBleomycin
肺间质纤维化是一种至今原因未明的疾病,成纤维细胞过度增殖及胶原蛋白在肺间质聚集是肺间质纤维化的重要标志［1］。肺间质纤维化早期病变基础是肺泡炎，在肺泡炎形成过程中涉及免疫效应细胞和细胞因子，某些细胞因子如肿瘤坏死性因子α（TNF-α）、转化生长因子β（TGF-β）在体外试验中证明可刺激人胚肺成纤维细胞前胶原mRNA的表达［2，3］。我们用博莱霉素A5诱发大鼠肺间质纤维化模型,对大鼠肺组织中 TNF-α,前胶原Ⅰ［(Pro α1 (I)］和前胶原 Ⅲ［Pro α1 (Ⅲ)］的mRNA进行观察。
材料与方法
1. 化学试剂：随机引物标记试剂盒(Promega ), α-32p dCTP 北京福瑞公司产品，异硫氰酸胍，β疏基乙醇、十二烷基磺酸钠（SDS) , 为美国Svera公司产品，琼脂糖进口分装，其余试剂≥分析纯（AR）。
2.重组质粒菌种及cDNA：含编码人的Pro α1（I）和Pro α1（Ⅲ）重组质粒菌种PHCAL1TU，PHFS3由北京阜外医院杨方博士惠赠，TNF-α cDNA片段由北京市肿瘤所高崇峰提供。β肌动蛋白（β-actin） cDNA 片段购自北京中山生物技术公司。
3.工具酶和分子量参照物：EcoRI、Pst I，λ DNA/Hind Ⅲ、pBR322、Hinf I 购自北京华美生物工程公司。
4. 动物与动物模型: 30只 Wistar 雄性大鼠，体重140～170 g，购自中国医学科学院动物中心 。 大鼠随机分为,经气管内一次性灌注生理盐水1 ml为正常对照组或灌注博莱霉素分为博莱霉素3、7、14、21、30天组,每组各5只。以乙醚麻醉大鼠，经气管内一次性灌注博莱霉素A5 5 mg/kg，于灌注后3、7、14、21、30天时处死大鼠，取右侧肺液氮速冻待检，左侧肺于10%的中性甲醛固定，HE染色。
5.cDNA 探针片段的制备：首先进行重组质粒抗性分析，然后选取单菌落按文献［4］依次进行重组质粒小量扩增，碱裂解法提取，限制性内切酶图谱分析；最后大量扩增提取质粒，酶切后以Pro α1（Ⅰ）670bp 和Pro α1（Ⅲ）705 bp cDNA作为探针，用酚冻融法回收，-20℃保存待用。
6.肺组织总RNA提取：按改良后的异硫氰酸胍-饱和酚-氯仿方法提取总RNA［5］，琼脂糖-甲醛电泳和紫外分光光度计，鉴定提取的质量和纯度。
7 .分子杂交［4］: （1）点膜和Northern 转移：待测的总RNA 用等体积10×盐水柠檬酸钠（SSC）点于预湿过的硝酸纤维素（NC）膜上；20 μg总RNA 经1.0%琼脂糖-甲醛电泳分离，再经Northern 吸印转移到NC 膜上，将NC 膜置于80℃，烤2小时，真空保存。（2）探针标记：用随机引物试剂盒（Promega），α-32p dCTP 标记预先变性cDNA 探针，经quick-spin Column纯化。（3）分子杂交：将点印和转印好的膜在预杂交液杂交3～4小时，弃去预杂交液，在50%甲酰胺体系内加入已标记的探针，杂交24小时，然后NC膜用2×SSC-0.1%SDS，洗膜2次，每次10分钟，0.2×SSC-0.1%SDS,60℃,洗膜20分钟,-70℃下用X线爆光72小时,洗印胶片后,经灰度扫描求得积分面积(单位为mm2)表示特异性mRNA 的相对含量。
8.统计处理：应用SAS软件统计分析,各组数据均以x±s表示，两样本均数比较采用 t检验。
结果
一、大鼠肺间质纤维化模型病理
大鼠肺组织经HE染色，光镜下灌注博莱霉素后3、7天表现为明显的急性炎症期，肺间质及肺泡内有大量的多核及单核细胞浸润，伴有水肿和轻度出血，14天炎性细胞明显减少，成纤维细胞增多，肺泡隔明显增宽，有胶原沉积，21、30天时肺泡腔明显缩小，肺间质被胶原替代。
二、大鼠肺组织Pro α1（I），Pro α1（Ⅲ）mRNA 表达
应用半定量斑点杂交显示，博莱霉素灌注后Pro α1（I）mRNA表达水平的7、14、21、30天明显高于正常对照组，t值分别为10.56、10.03、19.10、16.67(P＜0.01)，而Pro α1（Ⅲ）mRNA 7、14天的表达明显高于正常对照组(t值分别为24.23、17.06，P＜0.01）。7天肺组织开始有Pro α1（Ⅰ）和Pro α1（Ⅲ）mRNA表达，高于正常对照组（P＜0.01)，14天达到峰值水平分别是正常对照组的3.8倍和5.5倍。30天 Pro α1（I）的mRNA表达水平高于正常对照组（t值为16.67，P＜0.01)，而Pro α1（Ⅲ）mRNA表达水平则与正常对照组相接近(t值为1.95,P＞0.05)。Northern 显示，Pro α1（I）mRNA有两个转录模板分别位于5.4和6.5 kb,其中5.4 kb mRNA 转录模板是主要的;Pro α1（Ⅲ）也有两个转录模板分别位于6.0 kb和5.4 kb,其中6.0 kb是主要的。
三、大鼠肺组织TNF-α mRNA的表达
斑点杂交显示，灌注博莱霉素A5后3、7天大鼠肺组织的TNF-α mRNA表达水平明显高于正常对照组，分别是对照组的3.1倍和5.1倍 ,t值分别为10.33、12.54(P＜0.01，附表)。
