关键词： 肺肿瘤；端粒酶；支气管肺泡灌洗液

【摘要】目的探讨端粒酶活性在肺癌支气管肺泡灌洗液（BALF）细胞中的表达与肺癌发生机制的关系。方法应用银染-多聚酶链方法对肺癌患者和支气管、肺良性疾病患者各30例的BALF细胞端粒酶活性的表达进行检测。结果肺癌患者BALF细胞端粒酶活性83%阳性表达，支气管、肺良性疾病BALF细胞表达均阴性（P＜0.001）。同一肺癌患者患侧肺端粒酶活性在BALF细胞83%表达，健侧肺阳性表达27%。结论端粒酶活性是肺癌诊断的标志物之一，与肺癌的发生发展密切相关。

Determination of telomerase activity in BALF cells from lung cancer patients

Chen Luqi, Chen Luyu, Wang Ning. Henan Provincial Chest Hospital, Zhengzhou 450003

【Abstract】ObjectiveTo investigate the telomerase activity in BALF cells from patients with lung cancer.MethodThe silver staining and PCR techniqne were used to detect the telomerase activity in BALF cells from 30 patients with lung cancer and 30 patients with chronic bronchitis or benign pulmonary diseases.ResultThe telomerase activity in BALF cells was positive in all the patients with lung cancer (25/30, 83%), and in none of the patients with chronic bronchitis or benign pulmonary diseases (0/30, 0%). The difference was highly significant (P＜0.001). In the same patient with lung cancer, the positive rate of telomerase activity was 83% in BALF cells from the diseased lung, but only 27% in BALF cells from the normal lung (P＜0.001).ConclusionThe telomerase activity may be used as a diagnostic marker for lung cancer. There is a correlation between telomerase activity and the development of lung cancer.

【Key words】Lung neoplasmTelomerase activityBronchoalveolar lavage fluids

人类与衰老的研究中，发现体细胞内存在的一种长期休眠的基因，一旦活化可使体细胞逃脱衰老变成永生化细胞，这种基因被命名为端粒酶^［1］。近年来的研究发现，绝大部分肿瘤细胞中都存在有端粒酶活性的阳性表达，提示端粒酶是一个广泛的肿瘤标志物，自kim等^［2］利用以多聚酶链反应(PCR)为基础的端粒重复片段扩增法（telomeric repeat amplification protocl,TRAP）检测端粒酶活性以来，端粒酶与肿瘤的关系成为研究热点^［3］，但端粒酶活性与肺癌的关系如何，目前研究尚少，我们用TRAP法结合银染技术检测了支气管-肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluids，BALF）细胞端粒酶活性在肺癌和良性支气管、肺疾病患者的表达情况，并对端粒酶活性和肺癌临床病理学特征的关系做了初步的研究。

对象与方法

1.研究对象：未经治疗的肺癌患者30例，男22例，女8例，平均年龄50岁（28～76岁）。吸烟者20例，占66%（22/30）。全部病例均经病理证实，其中鳞癌16例，腺癌8例，腺鳞癌2例，小细胞肺癌4例（局限型2例，广泛型2例）。按照TNM分期，Ⅰ期19例，Ⅱ期5例，Ⅲ期4例，Ⅳ期2例。对照组：未经治疗的30例支气管、肺良性疾病患者，男18例，女12例，平均年龄46岁（25～70岁）。吸烟者18例，占60%（18/30）。本组慢性支气管炎10例，慢性支气管炎并肺部感染7例，肺炎8例，肺结核5例。

2.方法^［4］：(1)应用Olympus BFB3R型纤维支气管镜(纤支镜)行常规检查，于活检和刷检前做支气管肺泡灌洗。按患侧病变选择灌洗肺段，为避免在灌洗中混入大气道成分，在侵及段支气管口管壁的病变临近的肺段进行灌洗，良性疾病患者均选用右肺中叶或左肺舌叶做灌洗，将纤支镜顶端严密楔入段或亚段支气管开口处，先经活检孔注入2%利多卡因1～2 ml，做灌洗肺段的局部麻醉，然后从分检孔注入室温无菌生理盐水100 ml，分3次注入，每次注入后，立即在6.7～26.6 kPa（50～200 mmHg）的负压下吸出，一般回收量在40%～60%。回收液经单层纱布过滤2次，4℃,1 200 r/min,离心10分钟，离心细胞置液氮中保存（-80℃）。(2)细胞提取液制备：自液氮中取出细胞用冷磷酸盐缓冲溶液(PBS)冲洗离心2次，用冷PBS调整细胞数为5×10⁶/ml，冷洗液洗涤1次，离心，冷裂解液20 μl稀释细胞数至10⁴～10⁶，0℃孵化30分钟，离心后吸出含端粒酶的上清液。(3)蛋白定量：细胞提取物1～2 μl行考马斯亮兰G250蛋白定量。蛋白浓度一般稀释在3 μg/μl进行端粒酶活性检测。(4)端粒酶活性检测：按TRAP法。TS引物：5′-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3′，CX引物：5′-CCCTTACCCTTACCCTT-ACCCTTA-3′均由美国Sybersyn公司提供。PCR反应体系：5 μl×10PCR缓冲液，TS引物0.1 μg,500 μmol/L，4×dNTP 5 μl，细胞提取物2 μl（3 μg/μl蛋白质），dH₂O水加至总体积48 μl，50 μl石蜡封顶，25℃孵化30分钟，预热至90℃，1分钟，迅即加入1 μl CX引物，3U Taq DNA聚合酶。PCR扩增，94℃30秒，50℃30秒，72℃45秒，重复30次，最后1个循环为94℃30秒，50℃30秒，72℃1分钟。(5)铸胶银染：10%聚丙烯酰胺凝胶（180 mm×150 mm×0.4 mm）垂直电泳，6 μl载样缓冲液加3 μl PCR扩增产物点样，0.5×TBE电泳缓冲液，室温下10 mA恒电流1.5小时，电泳完毕，取下凝胶行银染，并照像及结果分析。

3.统计学处理：采用四格资料χ²检验。

结果

一、BALF细胞端粒酶活性

30例肺癌患者BALF细胞端粒酶活性检测83%阳性表达，30例支气管、肺良性疾病BALF细胞端粒酶活性全部阴性，二组比较差异有显著性(P＜0.001)。肺癌患者同时做双侧肺灌洗，30例肺癌患者的患侧肺83%(25/30)阳性表达，健侧肺27%(8/30)阳性表达，患侧肺明显高于健侧肺(P＜0.001)。

二、银染-TRAP法检测BALF细胞端粒酶活性的特异性及敏感性

通过加热、省去引物、RNase预处理使BALF细胞端粒酶失活或不能扩增做为对照。BALF细胞端粒酶活性阳性表达可见梯形条带，对照组端粒酶阴性表达皆无DNA扩增带型。将细胞提取物10倍稀释（0.6 μg），100倍稀释（0.06 μg）仍可检测到端粒酶活性。

三、银染-TRAP法检测BALF细胞端粒酶活性的稳定性

取2份BALF细胞样品（端粒酶活性阳性表达与阴性表达各1份），在3日内重复测试5次，结果表达一致。30例肺癌患者BALF细胞端粒酶阳性样品与临床病理诊断肺癌的符合率83%。

讨论

BALF细胞取自于癌组织所处的支气管、肺泡内，由于癌细胞易脱落，所收集的BALF细胞中除间质细胞、吞噬细胞、淋巴细胞等外，还含有一定数量的癌细胞。30例肺癌BALF离心沉淀细胞随机涂片5张，病理检查发现4张有癌细胞，因此灌洗液可以准确地反映肺实质病变情况和免疫过程，代表着肺泡结构的改变。本组研究结果表明肺癌BALF细胞端粒酶活性表达83%，对照组均阴性。临床病理学特征分析发现，端粒酶活性在肺癌BALF细胞中表达与组织类型、肿瘤大小、淋巴结转移、病理分期、分级、差异无显著性，但有严重吸烟史，肿瘤直径＞3 cm，有淋巴结转移，Ⅲ、Ⅳ期，低、未分化者端粒酶阳性表达相对较强。提示端粒酶活化与肺癌的发生、发展有关，是肺癌的特异性标志物之一，对于判断预后、指导治疗具有一定的价值。

我们研究所采用的银染-TRAP法具有敏感性高、特异性强、重复性好、可靠性强的特点。较kim等^［2］所采用的放射性自显影方法具有安全、省时、经济的优点，且灵敏度亦接近，因此本结果提示此方法可用于生化学端粒酶的研究和临床上对于肿瘤细胞、组织的端粒酶活性检测。

结果中提示8例肺癌患者健侧肺BALF细胞端粒酶阳性，因未行病理学检查，不能肯定为肺癌浸润。但一些学者^［5］认为，肿瘤现诊断依靠病理学上细胞形态学指标，而不是细胞的增殖能力，如果肿瘤细胞渡过了细胞凋亡的M₂期，即获得了永生化，永生化细胞存在端粒酶活性，具备了无限增殖的能力，因此，检测到端粒酶活性的细胞就是已具有无限增殖能力的永生化细胞（癌细胞）。

参考文献

1Greider CW, Blackburn EH.Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts.Cell,1985,43:405-413.

2Kim NW, Piatyszek MA,Prowse KR,et al. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer.Science, 1994,266:2011-2015.

3Rhyu MS. Telomeres,telomerase and immotality.J Natl Cancer Inst，1995,87:884-894.

4李振华,孙吉臻,侯显明，等. 弥漫性间质性肺疾病支气管-肺泡灌洗液细胞学检查的临床意义.中华内科杂志,1990,29:2-4.

5Hiyama K,Hiyama E,Ishioka S,et al. Telomerase activity in small cell and non-small-cell lung cancers. J