注：^*与对照比P＜0.05，^**与对照比P＜0.01，^△Vp-16作用浓度20μg/ml，^▲Vp-16作用浓度100 μg/ml以Vp-16作用于肺癌细胞，利用免疫细胞化学、流式细胞（FCM）及RT-PCR等技术，观察在不同药物剂量与作用时间下，凋亡相关基因bcl-2、bax、P53、C-myc与ICE mRNA及蛋白表达的动态改变，从而探讨其对小细胞肺癌（SCLC）及非小细胞肺癌(NSCLC)凋亡作用的异同。

材料与方法(1)细胞培养及Vp-16作用：2株SCLC细胞、1株腺癌细胞来自协和医院病理科及中国医学科学院肿瘤研究所细胞遗传室。复苏后以含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基，于37℃、5％CO₂条件下培养，每2～3天传代1次，初始密度1×10⁶/ml。细胞呈对数生长期时分别加入终浓度5、10、20、50、100、200 μg/ml的Vp-16，作用时间分别为8、12、36、48小时，以不加药物组为对照，重复试验3次。(2)免疫细胞化学染色：SP试剂盒及各凋亡相关基因蛋白抗体为中山公司代理Santa Cruz产品，收集细胞，制片，按常规进行染色。(3)FCM-抗体检测标本制备： 收集细胞1×10⁶，PBS洗两遍；70％冷乙醇固定过夜；PBS洗；加一抗4℃1小时；PBS洗；加异硫氰酸胍（FITC）标记二抗50μl（1∶50），4℃避光45分钟；PBS洗； 加RNaseA(50 μg/ml) ，室温30分钟，上机检测。(4)bcl-2引物：上游5′-CGACGACTTCTCCCGCCG-CTACCGC-3′，下游5′-CCGCATGCTGGGG-CCGTACAGTTCC-3′；C-myc引物：上游5′-ATTCTCTGCTCTCCTGGAC-3，下游5′-TCC-AGACTCTGACCTTTGCC-3′；-β-actin引物：上游5′-AGCATCCTAGAACTCTGTGC-3′，下游5′-ATTTCGGACCCCTGAACATA-3′。以上引物均由赛百盛公司代理、美国合成。其扩增产物分别为318、180、400bp。(5)RNA提取及RT-PCR：收集细胞1×10⁷，采用异硫氰酸胍法提取RNA^［1］。RT-PCR^［2］。以β-actin作内参照，阳性扩增带经密度扫描，比值（靶基因/β-actin）即为靶基因mRNA的相对量。(6)统计学分析：采用t检验。

结果(1)bcl-2、C-myc、p53等基因蛋白在肺癌细胞中的表达： 未经药物处理的2株SCLC，其中1株表达bcl-2、bax、p53、C-myc、ICE，另1株仅bcl-2、bax、p53表达。bcl-2、bax、ICE蛋白主要分布于细胞浆，p53蛋白主要分布于细胞核，而C-myc则胞核及胞浆内均有分布。未经药物处理的腺癌细胞仅见p53p及C-myc表达。(2)FCM-抗体检测肺癌细胞凋亡过程中bcl-2、p53等基因蛋白表达的动态变化： Vp-16诱导SCLC细胞凋亡过程中，随药物作用时间或浓度增加，2株SCLC细胞bcl-2表达均逐渐降低，bax逐渐增加，C-myc表达（仅1株细胞）亦上调，结合前已完成的工作，此改变早于DNA“梯”电泳；p53、ICE表达则无改变。Vp-16诱导肺腺癌细胞凋亡过程中，p53、C-myc随药物作用时间而改变，见附表。(3)Vp-16对SCLC细胞bcl-2、C-myc mRNA表达的影响：20 μg/ml Vp-16作用12小时后，SCLC bcl-2 mRNA相对量为0.88±0.32，24小时0.83±0.12，36小时为0.87±0.24，与未加药物的对照（0.90±0.18）相近（图1）。Vp-16作用 12、24、48小时，C-myc mRNA相对量分别为0.83±0.25、0.71±0.31、0.65±0.13，与对照相比（0.92±0.22），呈减少趋势（图2）。(4)Vp-16对腺癌细胞bcl-2、C-myc mRNA表达的影响：Vp-16作用12、24、48小时，腺癌细胞C-myc mRNA相对量分别为0.80±0.18、0.79±0.27、0.75±0.24，接近对照（0.85±0.16），无bcl-2 mRNA表达。

M：分子量标记，PBR322MSP₁

图120 μg/ml Vp-16致SCLC细胞bcl-2 mRNA变化

M：分子量标记，PBR322MSP₁图220 μg/ml Vp-16致SCLC细胞C-myc mRNA变化

讨论本组随Vp-16作用时间延长，SCLC细胞凋亡增多的同时^［3］，bcl-2、C-myc表达持续下降，bax呈上升趋势，且此种改变早于DNA“梯电泳”，表明bcl-2、bax、C-myc的协同作用可能是导致细胞凋亡的早期改变。此外，在Vp-16不同作用时间或浓度下，C-myc mRNA的降低与其蛋白表达率减低基本一致，而bcl-2在mRNA水平基本无改变，蛋白表达率却逐渐降低，提示Vp-16对SCLC C-myc、bcl-2的影响水平可能不同，前者可能影响 mRNA的形成及修饰，后者则可能影响蛋白翻译。Vp-16诱导SCLC细胞凋亡过程可能与p53及ICE无关。

药物诱导肺腺癌细胞凋亡过程中，随作用时间延长及凋亡细胞增多，p53表达率逐渐下降，而C-myc在Vp-16作用24小时，其表达略有升高，48小时则明显降低。表明Vp-16诱导肺腺癌细胞凋亡可能依赖于p53途经。突变型p53表达率下降与c-myc表达变化（先升高后降低）可能起协同作用。本研究未发现Vp-16诱导的SCLC及肺腺癌细胞凋亡与ICE有关。本课题受国家自然科学基金资助(基金编号：39570329)

参考文献

1Chomczynski P,Nicoletta S. Single sep method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform traction. Anal Biochem, 1987,162:156-158.

2Keith Fj, Bradburg DA, Zhu YM, et al. Inhibition of bcl-2 with antisense oligonucleotids induces apoptosis and increases sensitivity of AML blasts to Ara-C. Leukemia, 1995,9:131-138.

3王洁,王曾礼,朱元珏,等. 化疗药物对肺癌细胞凋亡的诱导作用研究. 中华内科杂志, 1998, 37:1-3.

(收稿：1998-07-07修回：1998-07-16)