关键词： 哮喘；一氧化氮；诱生型一氧化氮合酶；糖皮质激素；茶碱

【摘要】目的探讨糖皮质激素、茶碱对哮喘气道炎症和肺内一氧化氮(NO)水平、诱生型一氧化氮合酶(iNOS)表达的影响。方法BALB/c小鼠分为6组：哮喘模型组(A，10只)，正常对照组(N，10只)，地塞米松雾化吸入组(C₁，7只)，地塞米松腹腔注射组(C₂，7只)，布地奈德气雾剂组(C₃，7只)，茶碱组(T，10只)。建立哮喘模型，给予糖皮质激素、氨茶碱，观察支气管肺泡灌洗液(BALF)中白细胞总数、嗜酸性粒细胞百分比(EOS%)、总蛋白水平及NO水平的变化，用NADPHd组化法和iNOS免疫组化法观察肺组织内iNOS定位及表达情况。结果哮喘组BALF中白细胞总数(10.64±0.75)×10⁷/L、EOS%(12.55%±7.64%)、总蛋白含量(0.124±0.080 g/L)和NO水平(5.00±1.87 μmol/L)与正常对照组比较，差异有显著性(P＜0.001)，各指标数值分别为［(3.15±0.92)×10⁷/L，0.02%±0.04%，0.008±0.004 g/L，1.30±0.67 μmol/L］；肺内支气管上皮细胞iNOS表达增加；给予糖皮质激素后BALF中白细胞总数、EOS%总蛋白含量指标C₁：(5.05±1.14)×10⁷/L，0.10%±0.06%，0.016±0.011 g/L，1.20±0.97 μmol/L；C₂：(5.47±0.59)×10⁷/L，0.10%±0.08%，0.010±0.008 g/L；C₃：(6.53±0.47)×10⁷/L，0.24%±0.33%，0.020±0.012 g/L与哮喘组比较，差异有显著性(P＜0.001～0.05)，细胞内iNOS表达减弱；给予茶碱后明显抑制炎症，上述各项指标分别为［(3.65±1.04)×10⁷/L，2.84%±1.90%，0.012±0.008 g/L］，差异有显著性(P＜0.001～0.05)，但NO水平及iNOS表达无显著变化。结论EOS是哮喘气道炎症主要效应细胞，NO可能参与哮喘气道炎症。糖皮质激素和茶碱可抑制哮喘气道炎症；糖皮质激素抑制哮喘时肺内NO的产生；而茶碱则作用不明显。

The role of glucocorticosteroid and theophylline in asthmatic inflammation of murine model and the inhibition in NO production in lungYu Bing,He Quanying, Gao Zhancheng, et al. The Second Hospital of Beijing Medical University, Beijing,100044

【Abstract】ObjectiveTo investigate the role of glucocorticosteroid and theophylline in treatment of asthmatic inflammation and their effects in production of nitric oxide (NO)and the expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS).MethodA murine model was set up (A group: asthma model, N group: control mice), then the number of WBC, eosinophils%(EOS), total protein level and the NO level in brochoalveolar lavage fluid(BALF) were measured after treatment with glucocorticosteroid (C₁ group: dexamethason inhalation; C₂ group: dexamethason peritoneal injection and C₃ group: budisonide inhalation) and aminophylline(T group). The expression of iNOS was studied by histochemistry and immunohistochemistry.ResultThere was a significant increase in number of WBC ［(10.64±0.75)×10⁷/L vs (3.15±0.92)×10⁷/L， P＜0.001)，EOS% (12.55%±7.64% vs 0.02%±0.04%, P＜0.001),total protein level (0.124±0.080 g/L vs 0.008±0.004 g/L, P＜0.001) and concentration of NO (5.00±1.87 μmol/L vs 1.30±0.67 μmol/L，P＜0.001) in BALF after antigen challenge, and the expression of iNOS was increased in airway epithelial cells and alveolar macrophages. After administration of steroids and theophylline, the number of WBC［C₁：(5.05±1.14)×10⁷/L，C₂：(5.47±0.59)×10⁷/L，C₃：(6.53±0.47)×10⁷/L，T：(3.65%±1.04)×10⁷/L，P＜0.001］，EOS%(C₁:0.10%±0.06%，C₂:0.10%±0.08%, C₃:0.24%±0.33%，T：2.84%±1.90%， P＜0.001～0.005), total protein level (C₁:0.016±0.011 g/L, C₂: 0.010±0.008 g/L, C₃: 0.020±0.012 g/L, T:0.012±0.008 g/L, P＜0.001～0.05) were significantly decreased. There was a significant reduction of NO level (C₁:1.20±0.97 μmol/L, P＜0.001) and iNOS expression after treated with steroids, but no significant change after management with theophylline.ConclusionEOS is main inflammatary cell in asthma. NO may play an important role in aggravating asthma. Steroids and theophylline both can inhibit cell infiltration and serum protein leakage in asthma.Steroids can also inhibit the production of NO and iNOS expression. But theophylline has no significant effect in NO production in lung.

【Key words】AsthmaEosinophilsNitric oxideInducible nitric oxide synthaseGlucocorticosteroidTheophylline

哮喘的本质是以嗜酸性粒细胞(EOS)、淋巴细胞等炎性细胞浸润的气道慢性非特异性炎症。近来研究发现，哮喘时呼出气中一氧化氮(NO)水平显著升高^［1］，诱生型一氧化氮合酶(iNOS)在哮喘患者支气管上皮细胞^［2］和肺泡巨噬细胞^［3］内表达增加，认为NO可能参与哮喘气道炎症。糖皮质激素和茶碱均有抑制哮喘炎性细胞浸润^［4，5］和降低肺内微血管渗漏^［6，7］的作用。新近研究表明，糖皮质激素可抑制哮喘时肺内NO的产生^［8］，茶碱是否对肺内NO的产生有影响，尚少有文献报告。我们建立小鼠哮喘模型，分别给予糖皮质激素、茶碱治疗，观察支气管肺泡灌洗液(BALF)中白细胞总数、EOS%、总蛋白含量及NO水平，采用NADPHd组化法及iNOS免疫组化法观察iNOS定位和表达变化，旨在进一步阐明哮喘的发病机制和上述药物的作用机理。

材料与方法

1.实验动物分组：51只BALB/c雄性小鼠(体重20～25 g)随机分为以下6组：哮喘模型组(A，10只)，正常对照组(N，10只)，地塞米松雾化吸入组(C₁，7只)；地塞米松腹腔注射组(C₂,7只)，布地奈德气雾剂组(C₃，7只)，茶碱组(T，10只)。

2.哮喘模型的建立：腹腔注射卵蛋白(GradeⅡ，Sigma)抗原液0.5 ml(含Al(OH)₃ 2 mg和卵蛋白15 μg)致敏，7天后重复注射1次。致敏后第14天，雾化吸入0.5%卵蛋白生理盐水液，每次1小时，2次/日，共3天。

3.给药方法：地塞米松雾化组：每次激发前1小时雾化吸入地塞米松0.2 g/L，共10分钟；地塞米松腹腔注射组：每次激发前1小时注射地塞米松0.2 mg/kg；布地奈德气雾剂组：每次激发前1小时，喷入布地奈德1 mg，保存10分钟，2次/日。茶碱组：每次激发前1小时，腹腔注射氨茶碱20 mg/kg，2次/日。

4.BALF白细胞总数和EOS%的检测：腹腔麻醉小鼠，气管插管，用PBS缓冲液1 ml灌洗双肺，回收灌洗液，反复3次，对BALF进行白细胞总数计数；离心制成涂片，伊红-美蓝染色，进行细胞分类计数。

5.BALF总蛋白含量和NO水平测定：(1)用总蛋白测定试剂盒(购自中生公司)中试剂与标本反应，721分光光度计测吸光度值，计算标本中总蛋白含量，以反映肺内微血管渗漏的情况。(2)使用一氧化氮试剂盒(购自军事医学科学院)中试剂与标本进行反应，721分光光度计测吸光度值，计算标本中NO^₂/NO^₃含量，以反应肺内NO的水平。

6.肺组织标本染色：(1)激发后72小时处死动物，取部分右肺进行HE染色，观察哮喘组肺组织炎性细胞浸润的情况。(2)取左肺经多聚甲醛磷酸缓冲液及20%蔗糖缓冲液处理后，冰冻切片，NADPHd组化染色：切片上滴加200 μl新鲜配制的反应液(10 ml含NADPH四钠盐10 mg，NBT 5 mg，Trition X-100 0.3 ml，用0.05 mol/L pH 8.0的Tris缓冲液配制)，室温条件下放置45～90分钟后，终止反应，光镜下观察染色情况。(3)剩余右肺制成石蜡切片，进行iNOS免疫组化染色：切片预处理及微波修复后，封闭非特异性抗原，加入1:150 iNOS多克隆抗体(一抗，购自Santa Cruz公司)室温下30～40分钟，顺序加入生物素化羊抗兔血清(二抗)及酶标链霉亲和素(三抗)，二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)显色，脱水、透明、封片，光镜下观察阳性染色情况。

7.统计学处理：各指标(计量资料)以±表示。各组实验数据均用SPSS统计软件进行方差分析及秩和检验处理。

结果

一、小鼠模型肺组织病理改变

哮喘组肺组织切片HE染色可见支气管及血管周围大量炎性细胞浸润，以EOS为主，肺间质及肺泡腔也可见EOS存在(图1～3)。

二、各组BALF中白细胞总数和细胞分类情况

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