关键词： 缺氧症；高血压，肺性；离子通道；肺动脉

【摘要】目的研究慢性缺氧性肺动脉高压发生机制中钾通道活性改变的作用，及其开放剂卡吗克林(cromakalim)对钾通道活性的调控作用。方法20只Wistar大鼠随机分为对照组10只和缺氧组10只，缺氧组大鼠缺氧3周，每天缺氧8小时；运用急性酶分离法对Wistat大鼠肺动脉平滑肌细胞进行了分离；应用膜片钳小片膜单通道技术，分别对正常和慢性缺氧3周大鼠的肺动脉平滑肌细胞的钾离子通道进行了测定；记录并比较了两组大鼠肺动脉平滑肌细胞钙、ATP激活性钾通道(K⁺_Ca-ATP)和延迟整流性钾通道的活性，并观察了cromakalim对缺氧组大鼠钾通道的影响。结果慢性缺氧组大鼠肺动脉平滑肌细胞钙、ATP激活性钾通道(K⁺_Ca-ATP)和延迟整流性钾通道的活性均比正常组低，cromakalim可使慢性缺氧组K⁺_Ca-ATP的活性明显增高(P均＜0.01)。结论慢性缺氧可明显抑制大鼠肺动脉平滑肌细胞钾通道活性，这可能在慢性缺氧性肺动脉高压的发病机制中发挥重要的作用，钾通道开放剂cromakalim可作为降低缺氧性肺动脉高压的有效药物。

Inhibition of potassium channel by chronic hypoxia on pulmonary artery smooth muscle cells in ratsXiao Xinrong，Chen Wenbin，Cheng Deyun. Respiratory Department,First Hospital Affiliated to West China University of Medical Sciense, Chendu 610041

【Abstract】ObjectiveTo explore the possible effect of potassium channel in chronic hypoxic pulmonary hypertension.MethodMale Wistar rats were placed in the identical normobaric or hypoxic environmental chamber. In one chamber, rats were maintained in 10%±0.5% O₂ (by displacement with N₂) for 3 weeks, whereas in the other, rats were maintained in air. The single smooth muscle cell was isolated from pulmonary artery (ψ 200～700 μm) of Wistar rats with acute enzymatic digestion method. Using patch-clamp technique, we recorded the outward K⁺ currents in pulmonary artery smooth muscle cells and identified a Ca²⁺. ATP activated K⁺ channel (K⁺_Ca-ATP) and a delayed rectifier K⁺ channel among the outward K⁺ currents. We compared the activities of Ca²⁺.ATP activated K⁺ channel (K⁺_Ca-ATP) or delayed rectifier K⁺ channel in smooth muscle cells isolated from pulmonary artery of chronic hypoxic and normoxic rats.ResultThe activities of

Ca²⁺.ATP activated K⁺ channel (K⁺_Ca-ATP) and delayed rectifier K⁺ channel in chronic hypoxic group are much lower than that in normal group (T test, P＜0.01). Cromakalim (10 mmol) caused a marked enhancement of activity of the reduced K⁺_Ca-ATP but not the delayed rectifier K⁺ channel in rats of hypoxic group.ConclusionThe persistent decrease of potassium channel activity may contribute to setting the development of chronic hypoxic pulmonary hypertension. Cromakalim, one of potassium channel openers, can decrease the pulmonary hypertension induced by chronic hypoxia and may be a new effective drug for treatment of hypoxic pulmonary hypertension.

【Key words】AnoxiaHypertension, renalIon channelsPulmonary artery

有研究证实，慢性缺氧7天可使大鼠肺动脉主干平滑肌去极化^［1］。另有作者提出肺血管高张力的建立，可能是慢性缺氧对肺动脉平滑肌细胞静息膜电位的去极化作用，而且主要发生在直径≥200 μm的肺小动脉^［2］，而钾通道活性与血管平滑肌细胞的极化状态密切相关。因此，我们应用膜片钳小片膜单通道技术对正常和缺氧3周大鼠肺动脉平滑肌细胞的钾通道电流进行了比较，并观察了钾通道开放剂卡吗克林(cromakalim)对缺氧组大鼠钾通道活性的调控作用。

材料与方法

1.动物： 雄性Wistar大鼠20只，重250～320 g（购于华西医科大学实验动物中心）。随机分为正常对照组和缺氧组，每组各10只。

2.实验试剂和药物：胶原酶Ⅺ，4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸 (4-(2-hydroxyethyl-1-piperazine-ethanesulfonic acid,HEPES)，小牛血清白蛋白，木瓜蛋白酶(papain)，卡吗克林(cromakalim)，四乙铵(TEA)，4-氨基吡啶(4-AP)，ATP钠(Na₂-ATP)，乙烯乙二醇-双(β-氨基乙醚) -N,N,N′,N′-四乙酸(ethyline glycol-bis(β-aminoethyl ether )-N,N,N′,N′-tetraacetic acid, EGTA)和4,4′-双异硫氰酸芪-2,2′-双磺酸(4,4′-diisothiocyano-stilbene-2,2′disulphonic acid，DIDS，均购于SIGMA公司；二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)，购自Promega公司, HEPES缓冲的细胞分离液(HPSS)。

3.主要实验仪器：膜片钳放大器(CEZ-2200 Nihon konden，JaPan)，微电极拉制仪(PP-83 Narishige，JaPan)，微电极抛光仪(MF-83 Narishige)，倒置相差显微镜(IMT-2 Olympus，JaPan)，三维操纵器(WN203 Narishige,JaPan)，电子计算机(586)，数模转换器(Digital-1200 Axon instrument american)，激光打印机(Laserjet,ⅢHP)，微电极玻璃毛坯(上海脑生物研究所)。

4.动物缺氧：参照薛全福等^［3］报道的方法，将实验大鼠置于常压低氧舱内，舱内灌充氮气，使其氧分压下降，氧气监测仪测定开关控制舱内氧浓度为10%±0.5%，舱内CO₂和水蒸汽用钠石灰吸收，每天缺氧8小时，连续缺氧3周。

5.肺动脉平滑肌细胞的分离：正常对照组和缺氧组大鼠肺动脉平滑肌细胞均采用急性酶分离，大鼠麻醉后，剖胸，迅速游离肺脏，置于HPSS中，在体视显微镜下，分离出左、右肺动脉(ψ 200～700 μm)分支。将动脉管沿纵行方向剖开，并将血管壁剪成1 mm×1 mm的组织小片。在盛有组织小片的试管中加入低Ca²⁺的HPSS液2 ml(Ca²⁺，20 μmol/L)，内含胶原酶Ⅺ 1 mg/ml，木瓜蛋白酶1 mg/ml，小牛血清白蛋白2 mg/ml，37℃孵育酶解40分钟，低速离心(1 000 r/min)5分钟，用无Ca²⁺的HPSS液洗涤2次，再低速离心5分钟，均弃上清液。加入低钙HPSS 液4 ml，用尖端抛光、开口较大的巴斯德(pasteur) 吸管轻柔地吹打20分钟，即得到单个的肺动脉平滑肌细胞，4℃低温保存^［4］，8小时内备用。

6.高阻封接及膜片形成：在表面涂有1％多聚赖氨酸的盖玻片上，将分离好的肺动脉平滑肌细胞沉底，并用细胞浴液冲洗2次。在倒置相差显微镜下，选择分散的、形态典型、表面光滑的肺动脉平滑肌细胞，应用三维显微操纵器的粗推将微电极尖端与待测细胞接近，然后改换细推使微电极尖端与细胞表面接触，同时由计算机经膜片钳放大器向微电极发放一电压为0.1 mV，波宽为40 ms的脉冲方波，然后通过与探头相连的负压抽吸管向微电极尖端施以0.49～1.96 kPa(1 kPa=7.5 mmHg)的负压，使微电极尖端与细胞膜形成近似电绝缘，计算机显示其阻抗值≥1GΩ(1G=1×10⁹)，即形成高阻封接(giga-seal) ，这时形成的膜片为细胞贴附式(cell-attached patch)；此时，只要轻轻提起电极，将其尖端暴露于空气中几秒钟，即形成内面向外式膜片(inside-out patch)^［5］。在所需膜片形成后，通过灌流装置(2～3 ml/min)对待测细胞给予不同浓度的钙离子、ATP、钾通道阻断剂和钾通道开放剂，以观察不同因素对肺动脉平滑肌细胞的影响。

7.实验温度：所有膜片钳实验均在室温(20～24℃)条件下进行。

8.数据采集、输入与分析：(1) 数据采集及输入：数据采集与输入均使用Axon公司(Axon Instructment)软件pClamp 6.02，采样频率为33.33 kHz，采样方式为无间隔(Gap free)，每一钳制电压下膜片电信号的记录时间为10秒。(2) 数据分析：采用软件pClamp 6.02版本进行处理。数据处理后可得电导值、开放概率(P_OPEN)、开放时间(T_OPEN)、关闭时间(T_CLOSE)。

9.统计学处理：实验结果采用t检验，数据以±s表示。

结果

一、正常对照组大鼠肺动脉平滑肌细胞钾通道的分离及鉴定

采用内面向外细胞膜片，在两组大鼠的肺动脉平滑肌细胞膜上，均可记录到两种外向性钾电流。根据钾通道、单通道的电生理特性，以及加入特异性的钾通道阻断剂而将这两种钾电流分离。其中，一种电流的电导值较大，约240±10 pS，具有明显的电压依赖性，钙离子和ATP浓度的增加能使之激活，钾通道阻断剂TEA能特异性的阻断该通道，这种大电导的钾通道为钙、ATP激活的钾通道(K⁺_Ca-ATP)^［6］。另一<