关键词： 肺纤维化；巨噬细胞；成纤维细胞

【摘要】目的评价间质巨噬细胞(IM) 对成纤维细胞增殖的影响。方法在成纤维细胞培养液中分别加入肺纤维化大鼠肺泡巨噬细胞(AM)、IM培养上清培养。结果实验组第1天两种巨噬细胞的促增殖作用即开始升高,第7天达高峰(AM 332%,IM 342%，P＜0.01)；而IM和AM培养上清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、血小板源生长因子(PDGF)与成纤维细胞增殖活性水平成显著相关(r=0.657,0.713,P＜0.01)。结论不仅AM,而且IM也能释放促成纤维细胞体外增殖的细胞因子。由于IM与成纤维细胞紧密相邻, 对纤维化的形成可能更具有意义。

Studies on pulmonary fibrosis induced by interstitial macrophagesLü Changjun, Zhao Hongwen, Hou Xianming, et al. Department of Respiratory, The Affiliated Hospital, BinZhou Medical College, ShanDong 256603

【Abstract】ObjectiveTo evaluate the role of interstitial macrophages (IMs) in modulating the proliferative capacity of fibroblast(FB).MethodIMs isolated by collagenase IA digestion of disaggreted lung tissues from bleomycin-treated rats were studied in this regard.The culture supernatants of alveolar macrophages(AMs) and of IMs were added to culture media of FBs.ResultThe releases of growth factors by the two sub-populations of macrophage were already elevated on 1st day following bleomycin instillation, and peaked on 7th day at a level nearly 3-fold above that of control groups(IM 342%, AM 332%，P＜0.01). the proliferative capacity was correlated well with the levels of TNFα and PDGF (r=0.657,0.713, P＜0.01).ConclusionNot only AMs, but also IMs could release growth factors to modulate the proliferation of FBs in vitro. IMs might be of more signicance in maintenance of the process of pulmonary fibrosis because of its proximity to FBs.

【Key words】Pulmonary fibrosisMacrophageFibroblast

基于对肺纤维化发病机制的了解,越来越多的证据提示巨噬细胞可能发挥关键作用。既往研究表明,肺泡巨噬细胞(AM)可通过释放细胞因子调节成纤维细胞的生长;但间质巨噬细胞(IM)能否通过分泌细胞因子调控成纤维细胞的生物学活性尚缺乏研究。由于IM在肺间质的特殊位置,有理由设想它与成纤维细胞的关系较AM更为密切。基于这种观点,我们研究了IM、AM培养上清的促成纤维细胞生长活性与白细胞介素1(IL-1)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、血小板源生长因子(PDGF)水平的相关性,籍以证实IM分泌的这些细胞因子在肺纤维化中的作用。

材料与方法

1.动物模型制备及IM、AM的分离培养：博莱霉素致肺纤维化大鼠模型的复制与文献报道一

致^［1］。体重250 g的雌性大白鼠50只,实验环境训养1周,随机分为两组：(1)实验组(25只):经气管向肺内注入博莱霉素A₅ 0.2～0.3 ml(0.5 mg/100 g体重)。(2)对照组(25只):气管内注入生理盐水0.2～0.3 ml。两组动物分别于气管内灌注后第1、3、7、14、28天随机处死5只。左肺留待病理;右肺经支气管肺泡灌洗(BAL)收集上清,经离心、贴壁、纯化后收集AM。去除右肺胸膜、大血管和支气管,将肺组织剪碎、研磨、反复洗涤,然后置胶原酶IA 20 ml(175U/ml)中消化1小时(37℃),经离心、贴壁、纯化即获取IM^［2］。IM、AM调整细胞数后(10⁶/ml，RPMI 1640)分别置培养箱中培养12小时(37℃饱和水蒸汽),收集上清,-70℃保存待检。

2.IL-1、TNF-α、PDGF的检测：参见文献［3，4］。

3.IM、AM培养上清对肺成纤维细胞的促生长活性测定：利用组织培养技术,于平皿中将Wistar大鼠肺脏剪切成糜状,分别涂于组织培养瓶内培养(37℃,5％CO₂,培养基为10%小牛血清-RPMI 1640),每周换液2～3次,至成纤维细胞生长成交汇层以后进行传代培养。传至第4代时,用RPMI 1640配成1×10⁵/ml的细胞悬液,取每孔0.1 ml置96孔培养板中培养(条件同前),24小时后用2%小牛血清-RPMI 1640 0.1 ml替换原培养液,同时加待测上清0.1 ml,设平行3孔。48小时后结晶紫染色10分钟,冲洗,干燥,加正丁醇100 ml,振荡,测A值(曾称光密度OD值)。结果计算:增长百分率=实验组A值:对照组A值×100%。对照组A值为成纤维细胞于1%小牛血清(FCS)培养液中生长48小时的A值。

4.统计学处理：采用直线相关分析。

结果

一、IM、AM培养上清对成纤维细胞的促生长活性

IM、AM培养上清对成纤维细胞的调节作用见附图。在博莱霉素灌注后第1天,IM、AM培养上清的促生长活性即开始增高(157%,178%，P＜0.01),至第7天时达到最大促增殖能力,此时IM与AM之间的促增殖能力无明显差别(342%,332%,P＜0.01),随着时间延长,上清的促生长活性逐渐减弱,但至第28天仍保持这种活性。

附图AM、IM培养上清对成纤维细胞生长的调节作用

二、IM、AM培养上清IL-1、TNF-α、PDGF水平与成纤维细胞生长活性之间的相关性

IM、AM培养上清IL-1与成纤维细胞增殖活性之间无明显相关性(r=-0.415, -0.377,P＞0.05),而IM和AM培养上清中TNF-α、PDGF与成纤维细胞增殖活性之间有明显相关性(r=0.657,0.713,P＜0.01),说明TNF-α、PDGF可能是培养上清中成纤维细胞生长活性的来源之一。

讨论

巨噬细胞通过释放一系列致纤维化性细胞因子，调节成纤维细胞及细胞外基质的代谢。肺损伤后的修复过程多伴有肺内成纤维细胞增多,胶原沉积增加。为采取合理的干预手段,防止肺内不可逆性纤维化的形成,加深对肺纤维化发病机制及病理过程的了解是十分必要的。文献报道，肺内巨噬细胞在正常条件下并不产生有明显意义的致肺纤维化性细胞因子,但在气管内注入博莱霉素后,其促成纤维细胞增殖活性出现显著的动态变化,其高峰在第7天出现,很显然此变化不是博莱霉素对成纤维细胞的直接作用^［5］。为进一步探讨IM在肺纤维化中的作用,我们研究了IM对成纤维细胞的影响,结果发现实验组IM培养上清亦含有大量促成纤维细胞增殖的细胞因子,在病程中其水平的消长呈动态变化。IM作为居留在肺间质内的巨噬细胞亚群,其分泌的细胞因子以旁分泌的形式调节邻近的成纤维细胞活性,在肺纤维化的形成中可能较AM更具有意义。

文献报道,许多细胞因子可激活成纤维细胞。有学者发现在一些致纤维化性疾病中,AM释放IL-1增加,但近来研究表明，特发性肺纤维化肺组织中IL-1的含量并不升高,体外实验表明，AM条件培养上清的促成纤维细胞增殖作用与IL-1无关^［6，7］,而TNF-α、PDGF在肺纤维化中具有重要意义,无论在间质性肺疾病或动物模型,巨噬细胞释放的TNF-α、PDGF均增加^［7，8］。我们发现TNF-α、PDGF水平与促成纤维细胞生长活性相平行,呈显著相关性,说明TNF-α和PDGF在促进成纤维细胞生长中发挥重要作用。

我们认为,IM与AM类似,也能产生促成纤维细胞增殖的细胞因子,TNF-α和PDGF可能在肺纤维化形成中起重要作用。至于IM分泌的细胞因子在体内如何调控成纤维细胞,将有待进一步研究。

参考文献

1Piguet PF, Ribaux C, Karpuz V, et al. Expression and localization of tumor necrosis-alpha and its mRNA in idiopathic pulmonary fibrosis. Am J Pathol， 1993, 143: 651-655.

2Antoniades HN, Brovo MA, Avila RE, et al. Platelet-derived growth factor in idiopathic pulmonary fibrosis. J Clin Invest，1990,86: 1055-1064.

3Goldman R, Bar-Shavit Z. Dual effect of normal and stimulated macrophages and their conditioned medium on target cell proliferation. J Natl Canc Invest，1979，63:1009-1016.

4Siblle Y,Reynolds HY. Macrophages and polymorphonuclear neutrophils in lung defence and injury. Am Rev Respir Dis, 1990, 141: 471-501.

5Jovacs EJ, Kelly J. Secretion of macrophages-derived growth factor during acute lung injury induced by bleomycin. J Leukoc Biol，1985，37:1-14.

6Huninghake GW. Release of interleukin-1 by alveolar macrophages of patients with active pulmonary sarcoidosis. Am Rev Respir Dis，1984，129: 569-572.

7陈非,邓鸿业,丁桂凤, 等. 人肺泡巨噬细胞条件培养上清对人胚肺纤维母细胞生长的调节作用. 中国免疫学杂志，1991，7:355-358.

8Bollert FGE, Imrie M, Smith J, et al. TNF release from alveolar macrophages